一株源自长寿老人的嗜酸乳杆菌PBIL2-003的分离鉴定及特性与功能评价

张化朋，李凤娟，张颜廷，刘虹，庄金丽，刘敬兰，王静

(山东凤凰生物科技股份有限公司，山东 泰安，271000)

益生菌是指食用一定量后对机体健康有益的活的微生物，它们能够通过自身的繁殖代谢、调节微生物群的结构、发挥益生作用[1]。研究证实，肠道菌群是维持机体消化、代谢、免疫等重要生命活动平衡的重要因素[2]。免疫是人体健康的基石，机体免疫功能失调可能会引起过敏、炎症、肿瘤或易受到病原微生物感染等健康问题。研究显示，肠道菌群通过肠相关淋巴组织影响免疫系统的发展和调节，肠相关淋巴组织是机体抵御病原体、病毒和其他有害微生物的一道重要防线[3]。研究结果显示，益生菌可通过增强肠道黏膜屏障功能，提高机体抗氧化功能并降低炎症水平，调控免疫细胞活性和增强细胞吞噬功能等多种方式调节机体免疫功能，促进机体健康[4]。乳酸杆菌、双歧杆菌等通过发酵肠道中不易消化的成分产生短链脂肪酸等有益代谢产物，降低肠道pH值，促进黏膜细胞的生长、降低炎症、提高肠道的稳定性[5-6]。乳酸菌菌种资源丰富，广泛存在于动植物、空气、土壤等环境中，其中在动物体内和传统发酵食品中尤为丰富。长寿人群作为一个特殊群体，研究显示，其肠道菌群丰度及结构存在显著差异，肠道菌群丰度增加，具有更高的多样性，其中一些潜在的有益菌的丰度仍随着年龄而富集[7-9]。本研究拟从长寿老人粪便中分离筛选益生菌菌株，并对其进行系统的理化特性、抗逆性及安全性分析，以及小鼠体内免疫功能和调节肠道菌群的评价，以期开发新的益生菌菌种资源，为功能性益生菌菌株的产业化研究及应用提供性能优良、安全的菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级昆明小鼠(18±2)g(合格证：NO.370726200100423072)，济南朋悦实验动物繁育有限公司；MRS固体培养基、EMB琼脂(伊红美蓝琼脂)、BEA琼脂(叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂)、BBL琼脂、LBS琼脂、TSC琼脂(胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂)培养基、脱纤维绵羊血，青岛海博生物技术有限公司；浓盐酸、异丙醇、2-巯基乙醇，均为试剂纯，济南天泰化工有限公司；NaCl、K2HPO4、氢氧化钠、碳酸钠、谷氨酰胺、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐，均为试剂纯，天津凯通试剂公司；猪胆盐、胃蛋白酶、胰酶、RPM1640细胞培养液、小牛血清、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]、Hank’s液、青霉素、链霉素、药敏片，北京索莱宝试剂公司；YAC-1细胞，深圳市豪地华拓生物科技有限公司；乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40，NP40)，上海跃腾生物技术有限公司；环磷酰胺，山西普德制药有限公司；印度墨汁，上海华蓝化学科技有限公司。

1.2 仪器与设备

F50酶标仪，Infinite公司；CX21FS1电子生物显微镜，Olympus公司；ML204电子分析天平，Mettler Toledo公司；DHP-9162型电热恒温培养箱、BPN-50CH二氧化碳培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；CL5高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；THZ-C型恒温振荡器，苏州培英实验室设备有限公司；BCD-256 WDGH型冰箱，青岛海尔股份有限公司；SJ-CJ-2D超净工作台，苏洁净化设备有限公司；BHC-1300-A2生物安全柜，苏州通洁净化科技有限公司；LDZX-75KBS高压灭菌锅，山东新华医疗器械公司；PHS-3C酸度计，上海雷磁科学仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分离与鉴定

采集一位山东烟台市百岁健康老人的新鲜粪便，用无菌取样瓶封好后置入冰盒内，无菌条件下取粪便中部1 g样品至100 mL带玻璃珠的灭菌生理盐水中，180 r/min摇匀30 min后，移液管吸取1～2 mL摇匀的混悬液于灭菌MRS液体培养基中，37 ℃厌氧富集培养24 h后，用无菌接种针蘸取培养液在含3%(质量分数)CaCO3的MRS固体培养基划线，37 ℃厌氧恒温静置培养48 h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，接种到MRS斜面上培养24 h后进行革兰氏染色、镜检。纯化菌株送检中科院微生物研究所进行菌株生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等综合分析鉴定。

1.3.2 抗逆性与安全性分析

耐酸耐胆盐评价：将分离筛选获得的菌株活化后，接种于灭菌的液体MRS培养基中培养20 h，按4%转接量分别接种于pH 2.0和含0.3%(质量分数)胆盐的灭菌MRS液体培养基中，37 ℃培养，分别于0、1、2 h取菌悬液，进行平板菌落计数，计算菌株耐酸耐胆盐能力[10]。

人工胃液配制及菌株耐受性检测：准确量取20 mL的1 mol/L盐酸加蒸馏水调节pH值为2.5，加入胃蛋白酶(1 g/100mL)，充分溶解后，用孔径为0.22 μm滤膜过滤除菌即可。菌液按2%(体积分数)接种于模拟胃液中，在37 ℃条件下培养0.5、1、2 h，取样进行平板菌落计数，以0 h活菌数为对照，计算存活率[11]。

人工肠液配制及菌株耐受性检测：参照关小莺等[11]方法改进。取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水适量溶解，将两液混合后加水稀释至1 000 mL。菌液按2%(体积分数)接种于模拟肠液中，在37 ℃条件下培养2、4、6、8 h，取样进行平板菌落计数，以0 h活菌数为对照，计算存活率。

药敏试验：将纯化的菌体划线取单菌落，悬于3 mL生理盐水中，并调整菌体浊度为0.5麦氏单位。用棉签均匀涂布MRS培养基表面，用灭菌镊子取不同药敏纸片贴于培养基表面，培养18～24 h后取出，通过测量抑菌圈直径，确定菌株对不同抗生素的敏感程度[12]。

1.3.3 体内功能评价

体内功能评价实验方法参考保健食品检验与评价技术规范(卫法监发[2003]42号)。

1.3.3.1 动物分组及饲养

实验动物采用SPF级雄性昆明小鼠，体重(20±2) g，每组40只，预饲7 d后，进行灌胃给药处理；实验分组：设空白对照组、模型组、阳性对照组(某品牌增强免疫力保健食品，主要活性成分为1.1 g/100g总皂苷、0.3 g/100g粗多糖)和3个菌粉组，具体给药剂量见表1，连续给药30 d。空白对照组除外，在第20天连续2 d小鼠腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺(40 mg/kg)进行免疫抑制造模处理，连续灌胃30 d后，进行实验处理及指标检测[13-14]。

表1 动物实验分组及处理方式

1.3.3.2 免疫器官指数测定

末次给药结束后，禁食不禁水12 h，称量小鼠体重，采用断颈处死小鼠后，解剖取小鼠脾脏和胸腺，去除粘连组织，滤纸吸干后称重，免疫脏器指数计算如质量公式(1)所示：

(1)

1.3.3.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

小鼠实验期满，无菌取出脾脏，置于盛有Hank′s液的平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，经200目不锈钢网筛过滤，1 000 r/min离心5 min，用Hank′s液清洗两次，弃清液，收集细胞重悬于完全培养液中，用台盼蓝染色后计数活细胞数，保证活细胞比例≥95%，调整脾细胞浓度为3×106个/mL备用。

脾细胞增殖试验：将脾细胞悬液分两孔加入至24孔培养板中1 mL/孔，取一孔加75 μL 7.5 μg/mL的ConA液，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中连续培养68 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清RPMI1640培养液及50 μL浓度为 5 mg/mL 的MTT液，继续培养4 h，加入1 mL酸性异丙醇，吹打均匀至完全溶解紫色结晶后分装至96孔板，然后用酶标仪在570 nm处测定光密度值(OD)，添加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

1.3.3.4 小鼠血清凝血素的测定

小鼠血清凝血素的测定采用血凝法，取脱纤维绵羊血，用生理盐水洗涤离心(1 000 r/min，5 min)3次，将压积脱纤维绵羊血细胞用生理盐水配成2%(体积分数)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2 mL进行免疫，5 d后，摘除眼球取血，37℃水浴30 min使血清析出，离心(3000 r/min，10 min)收集血清。

取微量血凝板，每孔加100 μL血清，用生理盐水倍比稀释血清，再加入100 μL 0.5%(体积分数)SRBC悬液，混匀，加盖后于37 ℃培养箱孵育1 h，观察血球凝集程度。血清凝集程度按照5级(0～4级)记录，按照公式(2)计算抗体积数:

抗体水平=(S1+2S2+3S3……nSn)

(2)

式中:1，2，3……n代表倍比稀释的指数，S代表凝集程度的级别。

1.3.3.5 小鼠碳廓清实验

末次给药结束后，禁食不禁水12 h，称量小鼠体重，从小鼠尾静脉注射印度墨汁(100 mL/kg，生理盐水稀释4倍)，注入墨汁2 min和10 min后，用毛细管从眼眦静脉取血20 μL，立即吹打至2 mL 0.1%(质量分数)Na2CO3溶液中，用Na2CO3溶液作空白对照，测定600 nm处光密度值。同时处死小鼠，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血污后精确称重。按照公式(3)～公式(4)计算吞噬指数A:

(3)

(4)

式中：OD1为注射墨汁后2 min(t1)光密度值；OD2为注射墨汁后10 min(t2)光密度值。

1.3.3.6 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)活性测定

实验前24 h将靶细胞进行传代培养，用Hank′s液清洗3次，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。

效应细胞制备：无菌取出脾脏，置于盛有Hank′s液的平皿中，通过磨碎处理，制备单细胞悬液，过滤后用Hank′s液离心(1 000 r/min，10 min)处理清洗2次，加入灭菌水裂解红细胞，再加入Hank′s液进行离心处理，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640培养液重悬，用1%(体积分数)冰醋酸稀释后计数，保证活细胞比例≥95%，调整脾细胞浓度为2×107个/mL。

NK细胞活性测定，取靶细胞和效应细胞各100 μL，加入到U型96孔培养板中，作为反应孔，自然释放孔依次加100 μL靶细胞和培养液，最大释放孔依次加100 μL靶细胞和1%(体积分数)NP40，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养4 h，离心(1 500 r/min，5 min)处理，每孔吸取100 μL加入到平底96孔培养板中，加入100 μL乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)基质液，室温反应5 min，后加入30 μL 1 mol/L的盐酸溶液，用酶标仪在490 nm处测定光密度值(OD)。按照公式(5)计算NK细胞活性：

(5)

1.3.3.7 肠道菌群测定

实验动物剖杀后，无菌条件下取盲肠粪便，精确称取1 g置于100 mL生理盐水中，37 ℃恒温摇床振荡，采用平板计数法进行梯度稀释，选择合适梯度接种于不同细菌的选择培养基：EMB琼脂、BEA琼脂、BBL琼脂、LBS琼脂、TSC琼脂培养基，培养后以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，分别计算出每克湿便中肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌和产气荚膜梭菌的活菌数。

1.4 数据处理

采用SPSS Statistics 20软件对数据进行统计分析。试验数据均以平均值±标准误差表示，检验方法采用t检验，P<0.05为具有统计学意义，即差异显著，P<0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 分离与鉴定结果

通过鉴定分析，分离出的菌株属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，末端呈圆形，兼性厌氧菌，在pH 4.5～9.5生长，最适pH 6.5左右，接触酶和氧化酶阴性，γ溶血。菌体呈长杆状或者呈对状，两端钝圆，不产生芽孢(图1)；在MRS琼脂培养基中呈乳白色、半透明状圆形小菌落、边缘不规则。

图1 菌株的显微镜检图(×4 000)

菌体API 50CH系统鉴定如表2所示，该菌种属于同型发酵乳酸菌，能够发酵果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖。通过菌株细胞形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等综合分析，该菌株鉴定结果为嗜酸乳杆菌，命名为嗜酸乳杆菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)(简称L2-003)。

表2 菌株L2-003 API 50CH系统鉴定结果

2.2 抗逆性与安全性

菌株L2-003耐酸耐胆盐结果显示：在pH 2.0条件下，2 h内存活率>20%；在0.3%胆盐浓度下，2 h内存活率>20%，具有较好的耐酸耐胆盐能力(表3)。

表3 菌株L2-003在pH 2.0及0.3%胆盐的MRS液体培养基中存活率

菌株L2-003在人工胃液中存活率见表4，菌株L2-003在人工胃液中0.5、1、2 h时的存活率分别为61.18%、54.25%、50.24%，存活率较高，具有较好的耐人工胃液能力，与菌株L2-003具有较好的耐酸特性结果相符。

表4 菌株L2-003耐受人工胃液存活率

如表5所示,菌株L2-003具有较好的耐酸和耐胆盐特性，能够有效通过胃液和胆盐，并可在人工肠液环境中较好的存活并增殖。

表5 菌株耐受人工肠液存活率

对益生菌菌株的耐药性进行检测与分析，对于益生菌制品的安全性十分必要。菌株筛选过程中，应选择对常用抗菌药物敏感的菌株，以减少耐药性传递的安全隐患。选用常见的30种抗生素进行耐药性测定，参考美国临床实验室标准委员会的药敏试验标准进行分析，结果见表6，菌株L2-003仅对复方新诺明和阿米卡星有抗性，对庆大霉素中度敏感，对其余27种抗生素均敏感，说明菌株L2-003对抗生素耐药谱较窄，具有较高的安全性。

表6 菌株L2-003对抗生素的敏感实验结果

2.3 动物体内功能评价结果

2.3.1 小鼠免疫指标检测

实验过程中监控实验小鼠的生长情况及状态，结果显示,实验期中各实验组小鼠生长状况较好，体征及状态无不良变化，未出现明显疾病及死亡情况，表明菌株L2-003对实验小鼠无明显毒性作用。

小鼠免疫检测结果见表7，造模处理后，模型组的脾脏指数和胸腺指数显著降低(P<0.01)，说明使用环磷酰胺进行免疫抑制造模成功。与模型组相比，阳性组、中剂量和高剂量菌株L2-003给药组，小鼠的脾脏指数和胸腺指数显著高于模型组。付彦君等[15]研究报道乳酸菌可通过促进小鼠胸腺和脾脏等免疫器官的发育，提高机体免疫功能。本研究结果显示，阳性对照组与中高剂量L2-003组可通过促进小鼠免疫器官的发育，改善免疫抑制剂造模后小鼠的免疫功能；ConA诱导脾淋巴细胞增殖检测结果显示，空白对照组与模型组相比，光密度差值具有显著性差异(P<0.01)，说明免疫抑制剂环磷酰胺显著降低了小鼠脾淋巴细胞的增殖能力；阳性组、中剂量和高剂量L2-003菌株组光密度差值显著高于模型组(P<0.05)，高剂量组淋巴细胞增殖能力接近阳性对照组，说明一定剂量L2-003菌株可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖；空白对照组与模型组相比，抗体积数具有显著性差异(P<0.05)，说明免疫抑制剂显著降低了小鼠的抗体分泌能力；中剂量和高剂量L2-003菌株组抗体水平显著高于模型组，说明一定剂量L2-003菌株可以有效促进小鼠血清凝血素的分泌，增强小鼠机体体液免疫能力。

表7 不同处理小鼠脾脏和胸腺脏器指数、淋巴细胞增殖活性、血清凝血素、碳廓清指数、NK细胞活性检测结果

小鼠碳廓清实验是通过小鼠尾静脉注射墨汁，在不同时间测定小鼠的血液光密度值，在一定范围内，体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指数函数关系，计算吞噬指数表示小鼠碳廓清能力，来反映单核吞噬细胞对外来异物的吞噬功能，进一步体现机体的免疫能力[16]。小鼠碳廓清吞噬指数结果显示，与模型组相比，空白对照组对墨汁吞噬能力具有显著性差异(P<0.01)，说明免疫抑制剂显著降低了小鼠吞噬细胞的吞噬能力；与模型组相比，L2-003低剂量和中剂量组吞噬指数增加，但没有显著性差异；与模型组相比，L2-003高剂量组显著差异(P<0.05)，免疫抑制小鼠的细胞吞噬能力显著增强。

NK细胞由骨髓中的淋巴干细胞分化而来，可直接杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞和异体细胞。当细胞受到NK细胞杀伤后，活细胞胞浆内的LDH可以透过细胞膜，释放到胞外，进一步反应生成紫红色化合物，可在酶标仪490 nm比色测定，计算获得NK细胞活性，获得机体非特异性免疫水平。小鼠NK细胞活性检测结果显示，与空白对照组相比，免疫抑制模型组小鼠NK细胞活性显著降低；与模型组相比，阳性对照组、中剂量组小鼠NK细胞活性显著提升(P<0.05)，高剂量组差异极显著(P<0.01)。

2.3.2 小鼠肠道菌群检测

小鼠盲肠内菌群计数检测结果见表8，与空白对照组相比，通过免疫抑制剂处理，小鼠肠道乳酸杆菌数量极显著降低(P<0.01)，双歧杆菌数量显著降低(P<0.05)，肠杆菌和肠球菌无显著性变化，产气荚膜梭菌显著增高(P<0.05)，说明通过造模处理后，小鼠肠道菌群平衡被破坏；通过不同组给药处理后，与模型组相比，阳性对照组和低剂量L2-003活菌处理组对小鼠肠道乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌无显著影响。3个剂量L2-003活菌处理组双歧杆菌数量显著增加，中剂量组乳酸杆菌显著增加，差异显著(P<0.05)；高剂量组乳酸杆菌数量显著增加，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，低剂量组产气荚膜梭菌、中高剂量组肠杆菌和产气荚膜梭菌，显著下降(P<0.05)。一定剂量的L2-003可通过促进有益菌、抑制有害菌增殖，起到调节和平衡肠道菌群的作用。

表8 小鼠肠道菌群测定结果 单位：lgCFU/g

综上，嗜酸乳杆菌L2-003可有效改善免疫抑制小鼠肠道菌群，增强免疫器官指数及免疫细胞功能，促进免疫细胞增殖，提高免疫细胞活性，提高机体特异性免疫和非特异性免疫水平，在中高剂量体现出更高的免疫增强活性。说明菌株L2-003可顺利通过胃肠消化道进入机体并发挥益生作用，与生理生化和耐受特性结果一致。

3 结论与讨论

研究筛选食品可用益生菌菌株特性及其体内功能作用及其机理，对于菌株的产业化应用及进入体内后的安全性与功能性具有重要的意义。乳酸菌能否通过胃肠道低pH值、高胆盐浓度的环境存活，并可通过胃肠道的消化液消化而在肠道内黏附定植，对于其在肠道内的功能发挥至关重要。乳酸杆菌具有良好的抗生素敏感性，对酸和胆盐环境具有良好的耐受性，经口饲喂后无中毒情况发生，口服乳酸杆菌可以调节肠道菌群结构，表明供试菌株具有良好的安全性和益生特性，可作为生产用菌株应用[17-18]。本研究从健康长寿老人粪便中分离获得一株嗜酸乳杆菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)。研究结果证实，该菌株具有较好的耐酸、耐胆盐特性；药敏试验结果显示，L2-003仅对复方新诺明和阿米卡星有抗性，对庆大霉素中度敏感，对其余27种抗生素均敏感，说明L2-003对抗生素耐药谱较窄。以上结果显示，L2-003具有较好的抗逆性及安全性，可顺利通过胃肠道消化液并发挥益生作用，具有较好的应用价值。

肠道菌群是维持肠道系统功能的重要物质，肠黏膜表面形成的肠道黏膜屏障和免疫屏障是保障肠道菌群维持动态平衡的重要环节，免疫系统可以维持宿主与高度多样性并不断发展的菌群之间的共生关系，诱导对病原体的保护性应答。研究显示，益生菌可以通过自身增殖过程，产生有益代谢产物，调节肠道菌群，促进机体免疫功能，研究发现乳酸杆菌可以通过促进小鼠脾淋巴细胞增殖，激活免疫细胞活性，提高机体免疫分子分泌等作用，提高机体免疫力[19-20]。本研究结果显示，筛选出的嗜酸乳杆菌L2-003具有促进有益菌生长、抑制有害菌增殖的作用；体内免疫功能评价结果显示，L2-003可促进脾淋巴细胞的增殖，提高机体细胞免疫应答能力，促进机体抗体产生；显著增强巨噬细胞吞噬活性和NK细胞杀伤活性，广泛参与机体特异性免疫和非特异性免疫反应，显著提升免疫抑制造模小鼠的机体免疫力水平，具有较好的促进机体免疫功能。综上所述，嗜酸乳杆菌L2-003具有良好的抗逆性与安全性，具有调节肠道菌群和免疫提升作用，可作为功能性益生菌菌株应用于健康产品开发中。

大量研究报道显示，人体肠道菌群因遗传、饮食结构、生活方式、地理环境、年龄、性别及不同的健康状况等因素的差异，而具有显著性差异。长寿人群肠道菌群具有高多样性的典型特征；维持高多样性且均衡的肠道菌群对于老龄化过程中的健康可能起积极作用；健康长寿老人作为功能性益生菌菌种资源的特殊来源，已引起广泛关注[21]。作为一株具有良好产业应用价值的益生菌菌种资源，不仅需要其来源安全，同时还需要其具有良好的特性、安全性、功能性。尤其是作为可食用的益生菌菌株，其进入机体后与机体的肠道菌群以及代谢、免疫等重要的生理活动间的相互作用及影响，及其相互作用靶点和机理研究，均需要更深入的研究与探讨，以便为行业提供性能优良、食用安全的本土菌种资源，并为其产业应用提供严谨充分的参考依据。