板栗果实酚类物质及其抗氧化活性研究

李小艳，段鹏慧，张兴亮，兰彦平

1(山西林业职业技术学院，山西 太原，030009)2(北京市农林科学院林业果树研究所，北京，100093)

板栗(Castaneamollissima)壳斗科栗属坚果类植物，是我国古老的栽培果品树种，且有“干果之王”的美称[1]。板栗品种丰富，在我国分布非常广泛，是我国重要的生态型经济果树，其果实营养价值高[2]。近几年关于干果果仁及果皮品质研究增加，提升干果附加值的研究逐渐被人们重视，牟东岭等[3]以地方12个核桃品种为材料，通过对品质的分析，筛选出不同品质特点的核桃品种，为地方核桃产业提质增效提供理论依据。王琴等[4]对新疆5个巴旦木主品种进行果实香气品质分析，了解不同品种品质特点，为坚果不同加工利用提供参考依据。李杰等[5]对燕山地区3个板栗品种为试材，在“大板红”品种中检测到其他2个未有的特征香气，可作为香型鲜食果进行加工利用。魏欢等[6]对核桃绿壳中大量酚类化合物进行测定，在核桃绿壳发现了未被报到过的6-咖啡酸-d-葡萄糖和6-O-高酰甘酸葡萄糖苷物质，为进一步研究核桃绿壳，研发绿壳药理作用提供参考。AHAD等[7]为实现核桃绿壳资源的分级利用，利用水、石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取了不同极性的酚类化合物，并分别收集了乙酸乙酯层和水层，不同的酚类化合物根据其组成特性不同来应用于食品或添加剂的各种领域。

酚类化合物是一类广泛存在于植物体内的重要次生代谢产物,具有抗氧化、抑菌消炎、护肝益肾等保健功能，板栗果实中多酚是一种具有较好抗氧化活性的天然抗氧化剂[8]，且板栗壳是传统的中药成分，研究表明板栗壳中酚类化合物能够抑制肝细胞增殖和炎症[9]。AFRICA等[10]研究发现通过加热和压力处理相结合可以保持甚至提高开心果、腰果和板栗酚含量和抗氧化活性。邢颖等[11]通过研究水煮、烤制、炒制3种加工方式后板栗壳多酚、黄酮物质以及自由基清除率等，为板栗壳的应用提供了理论基础。目前关于板栗壳多酚物质的研究较多，但未见对壳外和壳内抗氧化物质分析的研究，通过对15个板栗品种果实壳外皮、壳内膜、果仁的总酚、总类黄酮、黄烷醇物质进行测定，分析不同品种果实不同部位抗氧化活性，而多酚的生理活性与其具有的清除自由基的抗氧化性能密切相关，通过测定DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原力，反映板栗不同品种不同部位抗氧化能力。通过主成分分析，挖掘板栗果实不同部位独特的活性功能，为板栗果实深加工利用提供科学依据，提高板栗附加值，也为板栗种质资源的研究、新品种的选育提供材料依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料采自河北农林科学院昌黎果树研究所板栗资源圃，果实成熟于冠层外围阴面和阳面进行随机采样，每个品种采5份，利用冰盒带回实验室进行指标测定。

碳酸钠、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、无水乙醇、香草醛、浓盐酸、DPPH、过氧化氢等(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；福林酚(分析纯)、没食子酸(色谱纯)、儿茶素(色谱纯)等，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-3000DE型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HermleZ326K台式高速离心机，上海圣科仪器设备有限公司；UV1902双光束紫外分光光度计，上海勤酬衡器有限公司；HH-6数显双列六孔水浴锅，上海康路仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

参照张京芳等[12]酚类抗氧化成分的提取分离工艺，称取0.55 g板栗壳外皮、0.11 g板栗壳内膜、0.55 g板栗果仁，充分研磨后加部分43%(体积分数)酒精于100 mL棕色容量瓶中，料液比为1∶18.5(g∶mL)，在超声功率305 W提取时间17.5 min，然后过滤，滤液于10 000 r/min离心10 min，滤渣重复提取、离心，重复提取3次，每次料液比均为1∶18.5(g∶mL)，合并上清液于100 mL棕色容量瓶，用43%酒精定容后作为提取液，每个品种重复5次。

1.3.1 酚类物质测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量，以没食子酸等价表示(mg/g)；采用氯化铝比色法测定总类黄酮含量，以芦丁等价表示(mg/g)；采用香草醛-盐酸法测定黄烷醇含量，以儿茶素等价表示(mg/g)。

1.3.2 抗氧化性能的测定

将提取液加入含有DPPH的甲醇溶液中，得到3 mL的反应体系后振荡混匀，在25 ℃下避光放置30 min后于517 nm下测定其吸光度。

将提取液与FeSO4溶液和水杨酸溶液混合后再加入H2O2溶液，得到6 mL的反应体系后振荡混匀，在37 ℃下水浴1 h，于510 nm下测定其吸光度。

将1 mL提取液稀释4倍与2.5 mL pH 6.6的磷酸缓冲液和2.5 mL 1%(质量分数)铁氰化钾溶液混合均匀，将该体系置于50 ℃恒温水浴 30 min，取出加入2.5 mL 10%(质量分数)三氯乙酸溶液,混匀后置于离心机内3 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%(质量分数)氯化铁溶液混合，700 nm下测定其吸光度。

1.4 统计分析

利用Excel 2019进行数据分析，通过Origin 2019b进行显著性与主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种板栗果实不同部位酚类物质比较

2.1.1 不同品种板栗果实不同部位总酚物质含量比较

总酚物质在植物抗逆反应中发挥着重要的作用，是重要的保健物质。图1展示了15个板栗资源果实不同部位总酚物质含量，由图1可知，不同资源果实总酚物质含量差异显著，且果实不同部位酚类物质含量差异明显。图1-a中板栗石丰和杂-35果实壳外皮酚类物质含量显著最高，其中石丰分别比广西玉林、广西油栗、燕红高550%、466%、457%(P<0.05)。板栗壳内膜总酚物质含量较高，由图1-b可知,15个板栗资源壳内膜总酚含量均在23 mg/g以上，其中黑燕青壳内膜总酚含量显著最高，为61.09 mg/g(P<0.05)。板栗果仁中总酚含量如图1-c所示，杂-35、燕平、桐优-33果仁中总酚含量较高，均高于1.62 mg/g，其中杂-35果仁中总酚含量是燕丰的18.46倍。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.1.2 不同品种板栗果实不同部位总类黄酮物质含量比较

酚类物质分为黄酮类和非黄酮类物质，其中黄酮类物质是一种重要的次生代谢物，在板栗壳内膜含量较高。图2展示了15个板栗品种果实不同部位总类黄酮物质含量差异，由图2-a可知，石丰和杂-35壳外皮总类黄酮含量显著最高，分别为1.08、1.04 mg/g，广西玉林和广西油栗壳外皮总类黄酮含量显著最低(P<0.05)；由图2-b可知，广西玉林和杂-35壳内膜总类黄酮含量显著最高(P<0.05)，但15个板栗品种壳内膜总类黄酮含量均在8.89 mg/g以上。果仁中总类黄酮含量如图2-c所示，金丰板栗果仁中总类黄酮含量显著最高(P<0.05)，桐优-33和杂-35果仁中总类黄酮含量显著高于鲁栗3号等9个品种(P<0.05)。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.1.3 不同品种板栗果实不同部位黄烷醇物质含量比较

板栗果实不同部位黄烷醇含量如图3所示，由图3-a可知，桐优-33和金丰板栗果壳外皮黄烷醇含量显著最高，且分别比燕平高30.56%、29.62(P<0.05)；鲁栗3号等8个品种果壳外皮黄烷醇含量低于1.00 mg/g。果壳内膜黄烷醇含量如图3-b所示，其中鲁栗3号、黑燕青、燕红果壳内膜黄烷醇显著最高(P<0.05)，均高于84.14 mg/g，桐优-33果壳内膜黄烷醇含量显著最低，但桐优-33果壳外皮和果仁黄烷醇含量均显著最高(P<0.05)，这说明果壳内膜中黄烷醇含量不影响果壳外皮和果仁中黄烷醇含量。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.2 不同品种板栗果实不同部位抗氧化活性比较

2.2.1 不同品种板栗果实不同部位DPPH自由基清除率比较

DPPH自由基和羟自由基清除率能够反映果实的抗氧化性能，15个板栗品种果实不同部位DPPH自由基清除率如图4所示，不同品种板栗壳外皮和果仁部位DPPH自由基清除率差异显著，由图4-a可知，金丰板栗壳外皮DPPH自由基清除率显著最高，分别比广西玉林和广西油栗高57.91%、63.70%(P<0.05)。板栗壳内膜DPPH自由基清除率较高，除金丰和燕平品种外，其他13个品种壳内膜DPPH自由基清除率均在87.00%以上，且差异不显著。而由图4-c可知，燕平果仁DPPH自由基清除率显著最高，这与燕平壳内膜DPPH自由基清除率显著最低相反。桐优-33和杂-35果仁DPPH自由基清除率显著低于燕平，但显著高于其他12个板栗品种(P<0.05)。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.2.2 不同品种板栗果实不同部位羟自由基清除率比较

羟自由基是一种活性氧，具有极强的氧化能力，板栗果实中清除羟自由基能力越强，说明板栗果实该部位抗氧化能力越强。图5展示了15个板栗品种果实不同部位羟自由基清除率，由图5-a可知，除品种石丰外，板栗壳外皮羟自由基清除率均较高，其中杂-35、广西玉林、黑烟青3个品种壳外皮羟自由基清除率显著最高(P<0.05)。由图5-b可知，15个板栗品种壳内膜羟自由基清除率差异明显，其中杂-35壳外皮和内膜羟自由基清除率均显著最高(P<0.05)。15个板栗品种果仁羟自由基清除率均在66.67%及以上，其中岱岳早丰、金平、广西油栗果仁羟自由基清除率显著最高，分别为93.59%、91.03%、93.59%，表现极强的抗氧化性。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.2.3 不同品种板栗果实不同部位还原力比较

不同品种板栗果实不同部位还原力如图6所示，由图6-a可知，广西油栗的壳外皮还原力显著最高，为97.46%，其次桐优-33、广西玉林、燕平壳外皮还原力显著高于其他11个品种。由图6-b可知，广西油栗等8个品种壳内膜还原力均在80.00%以上，且8个品种间差异不显著(P>0.05)，岱岳早丰壳内膜还原力显著最低，为61.49%(P<0.05)。由图6-c可知，果仁还原力较高，其中烟泉和广西油栗果仁还原力均为98.51%，显著高于其他13个品种(P<0.05)。

a-壳外皮;b-壳内膜;c-果仁

2.3 不同品种板栗果实不同部位酚类及抗氧化活性主成分分析

通过3种酚类物质及3种抗氧化物活性对15个板栗品种不同部位主成分分析得分图如图7所示，通过2个主成分可以有效地将板栗不同部位抗氧化能力区分开。由图7-a可知，板栗壳外皮酚类及抗氧化活性前2个主成分累计方差贡献率为76.23%，桐优-33、金丰、石丰品种在第一和第二主成分均为正值，其中石丰主成分得分最高，为壳外皮抗氧化能力较强的品种；由图7-b可知，壳内膜酚类及抗氧化活性前2个主成分累计方差贡献率为62.29%，在第一和第二主成分排名前三的品种为黑烟青>广西油栗>燕红，为壳内膜抗氧化能力较强的品种；在图7-c中，果仁前2个主成分累计方差贡献率为68.54%，其中桐优-33、燕平、杂-35板栗果仁主成分得分较高，果仁抗氧化能力表现较强。

3 讨论与结论

板栗果实中多酚是一种天然抗氧化剂，且板栗果壳具有药用保健功效，我国关于板栗的研发多集中在果仁，且板栗的育种以抗性、成熟期、产量、果实中淀粉、蛋白质等为重要指标[13-14]，关于板栗果实中酚类抗氧化物质作为指标进行选择性育种的工作开展得不多，缺乏相关理论指导。本研究通过采用超声波提取技术，对板栗果实不同部位酚类物质及抗氧化剂活性进行测定，表明板栗不同品种、不同部位酚类及抗氧化性能差异明显，且壳内膜总酚含量是壳外皮和果仁总酚含量的10倍左右，这可能与酚类相关的代谢基因在果实不同部位表达量不同造成[15-16]。刘政海等[17]对美乐葡萄不同营养系酚类研究发现，营养系间酚类含量差异显著，且果实不同部位酚类物质差异显著。弓志青等[18]对贮藏后的不同板栗总酚和抗氧化活性测定发现不同品种板栗果仁中总酚、DPPH自由基清除率等抗氧化物之间呈显著差异，这均与本研究中板栗不同品种间、果实不同部位酚类及抗氧化剂活性差异显著结论一致。AHAD等[19]研究抗氧化剂、温度、包装材料和贮存期对核桃酚类的影响，旨在增加核桃品种果实中的酚类抗氧化活性，提升核桃的保健功效。本研究中通过对15个板栗品种不同部位酚类及抗氧化活性测定，通过主成分分析，得出了板栗桐优-33、金丰、石丰品种壳外皮酚类抗氧化活性强，黑烟青、广西油栗、燕红为壳内膜抗氧化能力较强的品种，桐优-33、燕平、杂-35表现果仁抗氧化能力表现较强。李林晴等[20]对河北省9个核桃品种坚果特性进行测定，通过主成分分析选出5个适宜河北省栽植的品种。本研究中，15个品种均栽培在河北昌黎，不同品种间酚类及抗氧化活性的差异与环境有一定关系[21]，其中板栗桐优-33在昌黎地区壳外皮和果仁中酚类抗氧化物含量均较高，为优质抗氧化品种资源，且初次研究发现板栗壳内膜总酚含量均在20 mg/g，值得深入开发加工利用。研究结论为昌黎地区栽培高品质板栗品种、不同加工板栗品种、分级利用板栗果实提供理论和材料依据，提升板栗产业高质量发展。