基于人工神经网络优化黑木耳红枣发酵乳及其抗氧化分析

张剑林，张亮亮，姜露熙，裴龙英，王寒博，孙博，梁睿武，房丹丹

（新疆理工学院食品科学与工程学院，新疆 阿克苏 843100）

发酵乳是以鲜牛乳或乳制品为主要发酵原料，经一定时间及温度发酵而成的乳产品，其风味独特、营养丰富[1]。发酵乳中含有大量益生菌，能够有效地阻止有害细菌的繁殖，以此降低人体肠道内有害细菌及有毒物质含量，起到调节人体肠道菌群及增强人体自身免疫力的作用[2]。黑木耳作为食用菌，将其作为调味品加入乳品、饮料中等，可提升产品营养价值与抗氧化特性，并伴有更多的味觉感受[3-5]。红枣作为鼠李科枣属植物，富含有机酸、多糖、环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等活性物质，具有补气血、健脾益胃的功效[6-8]。黑木耳与红枣相结合，能促进总抗氧化能力系数的提高[9]。人工神经网络在发酵乳研究中未见报道。因此，黑木耳红枣发酵乳通过乳酸菌发酵，结合响应面设计和人工神经网络优化能够简单且快速地获得模型最佳值，以此制成一款新型高附加值且独特风味的发酵乳饮料[10-11]。

人工神经网络通过调整输入层、输出层、隐含层中有关联的相关神经元所对应的阈值，反映相互之间的非线性关系[12-15]。由于发酵乳产品成分及工艺的多元性，且发酵工艺参数与产品各属性指标间的关系大多是非线性的，因而人工神经网络能够较好适用于发酵乳产品属性的模拟。因此，本研究以酸度为衡量指标，研究多因素条件作用下的黑木耳红枣发酵乳工艺条件，应用人工神经网络建立并拟合发酵乳工艺，通过模型建立筛选、验证最佳发酵工艺参数，以期为发酵乳的高附加利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红枣：新疆阿克苏市温宿县；鲜牛乳：新疆天润生物科技股份有限公司；黑木耳、M30乳杆菌：新疆理工学院实验3号楼502实验室；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）试剂：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇：北京化工厂；硫酸亚铁：天津市光复科技发展有限公司；过氧化氢：开原化学试剂一厂；水杨酸：天津市华东试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BPH-9402精密恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；UV759紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；LDZM-80L立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；JMS-50胶体磨：廊坊市冠通机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

红枣汁、黑木耳粉、牛乳→复配→黑木耳红枣乳→胶体磨处理→巴氏杀菌→接菌发酵→黑木耳红枣发酵乳

1.3.2 黑木耳红枣汁的制备

选择新鲜、无机械损伤及虫蛀、色泽光亮的当年季灰枣。将红枣于温水中加一定量蔗糖洗去表面灰尘，再用水清洗1遍，沥干后去核，切成小碎块[16]。添加3倍水煮沸30 min后过滤备用，将粉碎过80目筛的黑木耳粉加4倍红枣汁过滤后制成黑木耳红枣汁。

1.3.3 发酵

将M30乳杆菌固体培养基从冰箱取出，在MRS肉汤培养基中接入挑取的单菌落，37℃培养48 h，经过多次活化使总活菌数为2.7×107CFU/mL，留作接种液备用。黑木耳红枣乳杀菌后，接入M30乳杆菌，设定不同恒温温度后在培养箱中培养一定时间，测定发酵液酸度及相应指标。

1.3.4 单因素试验

以酸度、活菌数、蛋白质含量作为评价指标，分别考察接种量（2.5%、4.5%、6.5%、8.5%、10.5%）、发酵时间（24、30、36、42、48h）、发酵温度（30、33、36、39、42℃）、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比（3∶1、2∶1、3 ∶2、1∶1、1∶2）对黑木耳红枣发酵乳的影响。

1.3.5 黑木耳红枣发酵乳工艺参数优化

选用酸度作为黑木耳红枣发酵乳的考察指标，选择接种量、发酵时间、发酵温度、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比作为黑木耳红枣发酵乳工艺影响因素进行优化试验，各参数水平如表1所示。

表1 黑木耳红枣发酵乳因素与水平Table 1 Coding table of factors and levels of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.6 遗传算法寻优设计

通过遗传算子，选择、交叉、变异，采取MATLAB遗传算法工具箱进行遗传算法以进行全局多点寻优[17]。人工神经网络模拟运算对黑木耳红枣发酵乳过程中的4个因素（接种量、发酵温度、发酵时间、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比）在各自加入量范围内采取人工神经网络模拟运算，以此模型的输出值构建个体适应度函数进行整体寻优。酸度值的浮动变化对个体适应度值的影响较大。通过实际情况进行初始种群数、变异概率、交叉概率和进化代数的选取，相关参数的设定根据实际而定[18-19]。黑木耳红枣发酵乳神经网络模型示意图见图1。

图1 黑木耳红枣发酵乳神经网络模型示意图Fig.1 Schematic diagram of neural network model of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.7 抗氧化能力测定

参照文献[20-21]的方法对DPPH·清除率、羟基自由基清除率进行测定。

1.3.8 活菌数和酸度的测定

参考文献[22-23]对活菌数和酸度进行测定。

1.4 统计分析

采用Origin 2018对单因素图表进行绘制，通过Design-Expert 8.0设计27组试验，且每一组做3次平行试验，采用Matlab 2017b进行模型构建。

2 结果与分析

2.1 不同因素条件对黑木耳红枣发酵乳的影响

接种量对黑木耳红枣发酵乳的影响见图2。

图2 接种量对黑木耳红枣发酵乳的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the fermented milk of black fungus and red jujube

由图2可知，当其它条件不变时，从总体上看酸度变化趋势呈先上升后趋于平稳的趋势，活菌数无明显变化，蛋白质含量略有起伏，其现象原因可能是M30乳杆菌接种量的多少与反应环境中菌体生长相关性较大，当发酵乳的接种量大于6.5%时，发酵乳所能利用的活菌数是有限的，致使酸度几乎无明显增长。因此，选择最适接种量为6.5%。

发酵时间对黑木耳红枣发酵乳的影响见图3。

图3 发酵时间对黑木耳红枣发酵乳的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the fermented milk of black fungus and red jujube

由图3可知，随着发酵时间的延长，酸度变化呈先上升后趋于平缓的趋势，可能是由于M30乳杆菌的接入使菌体大量生长繁殖促使酸度增大，当发酵至36 h时，M30乳杆菌的生长消耗了大量的碳源使乳酸菌的生长受到阻碍，导致活菌数变化减少。因此，选择最适发酵时间为36 h。

发酵温度对黑木耳红枣发酵乳的影响见图4。

图4 发酵温度对黑木耳红枣发酵乳的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the fermented milk of black fungus and red jujube

由图4可知，当发酵温度高于39℃时，酸度浮动变化减缓，原因可能是M30乳杆菌的生长对较高温度的耐受性较低，不利于其生长，从而会影响产酸特性。故选择最适发酵温度为39℃。

黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比对黑木耳红枣发酵乳的影响见图5。

图5 黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比对黑木耳红枣发酵乳的影响Fig.5 Effect of the ratio of black fungus and red jujube juice to fresh milk on the fermented milk of black fungus and red jujube

由图5可知，黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比对酸度影响较为明显，当黑木耳红枣汁的占比减少时，酸度呈先上升后趋于稳定的趋势，而活菌数总体呈小幅上升的趋势，可能是牛乳中的营养物质更有利于M30乳杆菌的生长。因此，选择最适黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比为3∶2。

2.2 酸度试验结果

各参数下黑木耳红枣发酵乳酸度如表2所示。共计29组试验，每组做3组平行，用于人工神经网络模型的构建。

表2 不同参数下黑木耳红枣发酵乳的酸度Table 2 Acidity of the fermented milk of black fungus and red jujube under different parameters

2.3 误差反传（error back proragation，BP）神经网络模型的构建

2.3.1 BP神经网络模型参数

神经网络模型的训练及构建使用Matlab 2017b软件完成。通过工具箱对神经网络训练的每一过程的迭代次数中训练数据集采取70%、15%、15%随机归类为训练部分、验证部分和测试部分进行迭代训练[24-25]。通过建模选择隐藏神经元个数为10，神经网络模型构建较好。

神经网络预测值和期望值之间的误差采用均方误差（mean-square error，MSE）函数表示，公式如下。

黑木耳红枣发酵乳的研究中，通过每组试验的实际值及神经网络输出的预测值，来评价酸度在神经网络预测中准确度，若模型预测性能越好，则期望值和预测值越接近。

2.3.2 神经网络模型构建的均方误差评估

神经网络模型构建的准确性建立在MSE评估的基础上。MSE值越小，所建立的模型越成功，试验数据所表现出的精确度越高[26-27]。黑木耳红枣发酵乳神经网络模型的MSE值见图6。

图6 黑木耳红枣发酵乳神经网络模型的MSE值Fig.6 MSE value of the fermented milk of black fungus and red jujube with neural network model

式中：n为参与评价的样本个数；yi为第i个神经网络的输出值为该输出值对应的期望值。

如图6所示，随着训练步数的增加，MSE误差逐渐趋近于最佳值，对应误差为0.041 569，同时验证误差也趋于最佳值，当神经网络模型迭代至第7次时，训练结果趋于平稳，说明该模型达到拟合要求[28-29]，可用于黑木耳红枣发酵乳工艺拟合研究。

2.3.3 神经网络模型相关系数的评估

黑木耳红枣发酵乳模型构建的相关系数指标见图7。

图7 黑木耳红枣发酵乳模型构建的相关系数指标Fig.7 Correlation coefficient index for model construction of the fermented milk of black fungus and red jujube

如图7所示，通过统计训练、验证、测试及所有数据的目标值和输出值，并计算出相关系数[30-31]。各组数据的相关系数R、目标值及神经网络模型的输出值呈显著的正相关关系，进一步确定了神经网络模型构建的成功。

2.4 人工神经网络模型性能测试

通过对所构建的神经网络模型选择收集的9组试验数据进行预测值与实际值随机验证[32-33]。以试验测得的实际酸度与神经网络预测的值进行比较，结果见图8。

图8 构建黑木耳红枣发酵乳模型性能的验证Fig.8 Validation of the model of the fermented milk of black fungus and red jujube

由图8可知，试验测定获取的酸度与神经网络模型预测值具有变化一致的趋势。因此，进一步说明通过此方式构建的神经网络模型所输出的预测值具有较高可行性。

2.5 遗传算法寻优

黑木耳红枣发酵乳遗传算法的寻优结果见图9。

图9 黑木耳红枣发酵乳遗传算法的寻优结果Fig.9 Optimal results of genetic algorithm for the fermented milk with black fungus and red jujube

由图9所示，通过采用Matlab 2017b软件对黑木耳红枣发酵乳进行工艺寻优，当遗传运算迭代至127次时，模型所对应的酸度预测值与实际值拟合度最佳，此时试验因素（黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比、发酵温度、发酵时间、接种量）编码分别为1.428、38.800、36.600、0.067，所对应黑木耳红枣发酵乳酸度理论值为75.12°T，与实际所测值无明显差异，该模型工艺优化结果准确。

2.6 抗氧化结果分析

不同浓度黑木耳红枣发酵乳与未发酵组抗氧化性能的对比见图10。

图10 不同浓度黑木耳红枣发酵乳与未发酵组抗氧化性能的对比Fig.10 Comparison of antioxidant properties of the fermented milk of black fungus and red jujube and unfermented milk with different concentrations

如图10所示，黑木耳红枣发酵乳未发酵组、发酵组的DPPH自由基、羟基自由基清除率随样液体积浓度的变化均呈先增长后趋于平稳的趋势。对于黑木耳红枣发酵乳发酵组而言，经过不同梯度的处理后，当样液体积浓度分别为0.6、0.8 mL/mL时，黑木耳红枣发酵乳的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率分别为81.30%、73.42%，均达到较高的清除效果，较发酵前分别提高了12.04%、13.52%，其发酵前后差异明显，在发酵过程中，抗氧化性有所增强，其可能原因是由于乳酸菌在发酵过程中使游离态酚类物质的占比增加[34]，进一步增强黑木耳红枣发酵乳抗氧化性。

3 结论

本试验以黑木耳粉、红枣汁、鲜牛乳为原料，通过乳酸菌发酵制成黑木耳红枣发酵乳，采用DPPH自由基、羟基自由基清除率评价发酵制品的抗氧化能力。根据发酵温度、发酵时间、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比、接种量4个影响因子为单因素试验，结合Box-Behnken试验的因素水平和响应值，将黑木耳红枣发酵乳的4个因素及对应酸度通过Matlab 2017b软件构建神经网络拟合其之间的非线性关系，模型预测性和准确性较高，能够反映发酵温度、发酵时间、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比、接种量与酸度之间的关系，通过与遗传寻优相结合，确定黑木耳红枣发酵乳的最佳工艺条件为发酵温度38.8℃、发酵时间36.6 h、接种量6.70%、黑木耳红枣汁与鲜牛乳体积比为3∶2.1，对应最佳酸度为75.12°T。在此条件下，黑木耳红枣发酵乳DPPH自由基、羟基自由基清除率分别为81.30%、73.42%，较发酵前分别提高了12.04%、13.52%，试验结果为黑木耳红枣发酵乳的综合开发利用提供参考。