4种粽叶多酚提取物对草鱼片的保鲜效果

汤晓，马明

（1.宁波职业技术学院化学工程学院，浙江 宁波 315800；2.宁波中盛产品检测有限公司，浙江 宁波 315800）

我国是世界上最大的水产品生产国与出口国，鱼类是水产品消费中的主要大类。鱼肉因其营养物质含量丰富，容易滋生微生物，促进酶的生长，从而导致腐败变质。为延长鱼类货架期，常用的保鲜方法是低温冷藏与化学保鲜技术。低温冷藏技术往往贮藏期短、能耗大，且对鱼肉品质有一定影响[1]。化学保鲜剂使用过量或残留，则会对人体健康以及环境安全产生负面影响[2]。相比之下，天然保鲜剂是目前国内外食品保鲜领域的研究热点之一，它们可通过抑制微生物的生长、降低水产品体内的酶活性、延缓氧化速度、降低水分挥发等作用来延长鱼类保存期，且成本较低、绿色环保[3-4]。

荷叶、箬叶、芦苇叶、槲叶等植物是我国南北各地区常见的粽叶材料，这些植物不仅能赋予食物特殊的香味，也因为含有多酚类化合物、挥发油、萜类化合物等生物活性成分而能抑制食物中细菌、霉菌、真菌等微生物的生长[5-7]。这些活性成分还具有抑制脂质过氧化物酶活性、清除各类自由基等抗氧化功能[8-11]。尽管荷叶、箬叶、芦苇叶、槲叶具有抑菌、抗氧化的功效，但目前尚未有报道系统研究它们在鱼肉保鲜中的应用。本文在前期分析几种粽叶多酚提取物成分[12]、抗氧化性能[12]与抑菌活性的基础上，进一步探讨它们对鱼肉的保鲜效果，以期为我国传统的粽叶材料在天然食品保鲜剂中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲叶：产自河南南阳；芦苇叶：产自江苏骆马湖；箬叶：产自安徽黄山；荷叶：产自山东微山湖，室温（30℃～36℃）自然干燥。活草鱼：市售。

乙醇、氧化镁、硼酸、盐酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；XAD-8大孔树脂：北京寰宇科创生物科技发展有限公司；食品级溶菌酶（18 000 U/mg）：江西华豫源生物科技有限公司；壳聚糖：湖北如天生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ-10C型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KH30R-II台式通用高速冷冻离心机：广州越特科学仪器有限公司；SB-80超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；60 mm布氏漏斗：江苏顺和教学仪器有限公司；80目标准筛：绍兴市上虞纱筛厂；XL-60C中药粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；SW-CJ-2FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；弗鲁克FA25均质机：上海右一仪器有限公司；K8400型全自动凯氏定氮仪：福斯分析仪器（苏州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物多酚提取物的制备

将干燥荷叶、箬叶、槲叶、芦苇叶分别粉碎后，过80目筛。分别称取10 g干燥荷叶、箬叶、槲叶、芦苇叶粉末，按照料液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇，在超声功率80 W、温度45℃下超声辅助提取50 min，提取两次，合并提取液。在4℃下10 000 r/min离心20 min，收集上清液。旋转蒸发浓缩上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤。再用XAD-8大孔树脂纯化上清液，上样流速1.0 mL/min，上样浓度2.5 mg/mL，以60%乙醇溶液为洗脱液，以1.5 mL/min流速收集洗脱液，洗脱液体积180 mL。旋转蒸发浓缩洗脱液，-60℃冷冻干燥48 h，粉末置于-20℃冰箱保存备用[13-14]。

1.3.2 抗菌液的制备

用去离子水溶解4种粽叶提取物粉末，制成抗菌液，使其浓度分别为30、60 mg/mL。以两种天然抗菌剂（溶菌酶、壳聚糖）为阳性对照，用无菌水分别调节其浓度至0.05%、1%。

1.3.3 鱼片处理

活草鱼宰杀后去鳞、洗净，取脊背肉切片，每片约20g，冰盒保存后立即送至实验室。用无菌水冲洗后，在无菌钢丝网上沥干待用。依次放入制备好的荷叶、箬叶、槲叶、芦苇叶、溶菌酶、壳聚糖抗菌液中，浸泡30 min。取出后在无菌钢丝网上沥干，放入无菌袋中，置于4℃冰箱贮藏。连续9 d取样进行各项指标测定，感官评定每2 d进行1次。以无菌水浸泡的鱼片作空白对照。

1.3.4 保鲜效果的测定

1.3.4.1 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》进行菌落总数测定[15]。

1.3.4.2 pH值的测定

称取10 g绞碎的鱼样品，在100 mL去离子中均质5 min，将混合物过滤，使用pH计测定滤液的pH值[16]。

1.3.4.3 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基总氮的测定》进行挥发性盐基氮（TVBN）值测定[17]。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的测定

称取2.0 g绞碎的鱼样品放入试管中，加入硫代巴比妥酸溶液3 mL、三氯乙酸-盐酸溶液17 mL混匀，沸水浴加热30min，迅速冷却至室温25℃。吸取反应后的样品5 mL，加入等体积氯仿，3 000 r/min离心10 min，在532 nm处测定上清液的吸光度。硫代巴比妥酸值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的质量表示[18]，计算公式如下。

式中：A532为样品的吸光度；M为样品的质量，g；9.48为从红色TBA反应产物的稀释系数和摩尔消光系数152 000 L/（mol·cm）得出的常数。

1.3.4.5 感官评定

草鱼鱼片的感官评定由10名经过感官评定培训的人员共同完成。评定标准如表1所示，每项指标的满分为10分。

表1 4℃贮藏条件下草鱼鱼片的感官评定指标Table 1 Sensory evaluation indexes of grass carp fillets stored at 4℃

1.3.5 数据处理与分析

所有试验均重复3次，采用单因素方差分析结果（ANOVA），使用IBM SPSS 21.0软件进行结果的差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 4种粽叶提取物对微生物的影响

草鱼片在冷藏过程中的菌落总数变化如表2所示。

表2 鱼片冷藏过程中的菌落总数变化Table 2 Changes of total viable bacterial counts in fish fillets during cold storage

由表2可知，随着冷藏时间的延长，生鱼片中的菌落总数逐渐上升。用无菌水浸泡的对照组菌落总数上升最快，冷藏第4天时，生鱼片中的菌落总数已达6.51 lg（cfu/g），超过 GB 10136—2015《食品安全国家标准动物性水产制品》规定的不大于6 lg（cfu/g）的腐败限值标准[19]。而荷叶、箬叶、槲叶、芦苇叶提取液以及溶菌酶、壳聚糖溶液处理均能在不同程度上抑制鱼片中的微生物生长。冷藏第4天时，各抗菌液中的菌落总数均未超过标准值，最大值为5.90 lg（cfu/g）。冷藏第5天时，除低浓度箬叶、槲叶外，其他抗菌液中的菌落总数仍在标准值以下。冷藏第6天时，高浓度荷叶、高浓度芦苇叶、溶菌酶抗菌液中的菌落总数保持低于标准值。冷藏第7天时，溶菌酶抗菌液中的菌落总数仍在标准值以下。冷藏8 d时，所有组菌落总数均超过6 lg（cfu/g）的腐败限值标准。

在9 d冷藏期内，槲叶、箬叶溶液之间，芦苇叶、壳聚糖溶液之间的抑菌效果接近，而荷叶、溶菌酶溶液的抑菌效果则明显高于其他抗菌液。由此可见，荷叶、芦苇叶具有更强的抑菌作用，其抑菌效果与壳聚糖、溶菌酶这两种天然抗菌剂相当，且高浓度更有利于4种粽叶提取物发挥抑菌作用。童佩[20]利用最低抑菌浓度为10 mg/mL的五倍子提取液进行草鱼保鲜，其抑菌效果不及溶菌酶（P＜0.05），但与壳聚糖的抑菌效果接近（P＞0.05）。研究表明，五倍子中含有丰富的多酚类化合物，具有良好的抑菌效果，几种粽叶中的多酚类物质也较多[21]，由此推测，当粽叶中的多酚类物质达到一定浓度时，其抑菌作用可能更为有效。

2.2 4种粽叶提取物对pH值的影响

草鱼片在冷藏过程中的pH值变化如表3所示。由表3可知，受鱼肉体内水解酶及微生物的影响，随着冷藏时间的延长，生鱼片中的pH值先下降后上升。用无菌水浸泡的对照组pH值变化最大，冷藏2 d后，pH值开始上升；冷藏4 d后，pH值上升较快，冷藏第9天的pH值与第4天相比，上升了7.94%。而荷叶、箬叶、槲叶、芦苇叶提取液以及溶菌酶、壳聚糖溶液处理均能在不同程度上抑制鱼片中的pH值变化。冷藏4 d后，pH值开始上升。其中，荷叶、溶菌酶、壳聚糖、高浓度芦苇叶溶液对pH值升高的延缓效果明显高于其他抗菌液。在冷藏后期，所有抑菌液组pH值上升的原因可能是生鱼片中的组织蛋白酶被持续释放，鱼片中的微生物使抑菌液中的蛋白质分解，产生氨、胺类等碱性物质，从而引起pH值的升高[22]。

表3 鱼片冷藏过程中的pH值变化Table 3 Changes of pH value in fish fillets during cold storage

低浓度槲叶与箬叶抗菌液延缓pH值升高的效果相当，冷藏第4天的pH值均下降了3.28%，冷藏第9天的pH值与第4天相比，分别上升了5.48%、5.33%。高浓度槲叶与低浓度芦苇叶抗菌液延缓pH值升高的效果相当，冷藏第4天的pH值分别下降了2.99%、2.98%，冷藏第9天，pH值与第4天相比分别上升了5.03%、4.85%。高浓度箬叶延缓pH值升高的效果明显高于高浓度槲叶，低浓度槲叶、箬叶与芦苇叶抗菌液，冷藏第4天的pH值下降了2.99%，冷藏第9天的pH值与第4天相比，上升了4.21%。高浓度芦苇叶与壳聚糖抗菌液延缓pH值升高的效果相当，冷藏第4天的pH值分别下降了2.84%、2.83%，冷藏第9天，pH值与第4天相比分别上升了4.07%、3.89%。低浓度荷叶与溶菌酶抗菌液延缓pH值升高的效果相当，冷藏第4天的pH值分别下降了2.86%、2.85%，冷藏第9天，pH值与第4天相比分别上升了4.08%、4.08%。高浓度荷叶抗菌液延缓pH值升高的效果最佳，冷藏第4天的pH值下降了2.38%，冷藏第9天的pH值与第4天相比，上升了4.07%。由此可见，4种粽叶提取物均能有效控制生鱼片的pH值变化，可使pH值上升延缓2 d，且pH值升高缓慢。其中，高浓度芦苇叶提取液、低浓度荷叶提取液对pH值升高的控制效果分别与壳聚糖、溶菌酶相当，而低浓度荷叶提取液对pH值升高的控制效果则优于溶菌酶。

Dai等[23]利用茶多酚浸泡鱼片，可使鱼片的pH值升高延迟1 d。邵东旭等[24]利用鱼鳞胶原蛋白复合抗菌膜进行鱼肉保鲜，可使鱼肉的pH值升高延迟2 d。曾维伟[25]利用乳酸菌细菌素进行鱼片保鲜，可使鱼片的pH值升高延迟2 d～4 d。由此可见，与其他天然抑菌材料相比，4种粽叶提取物同样可以有效控制生鱼片中的pH值变化。

2.3 4种粽叶提取物对挥发性盐基氮的影响

草鱼片在冷藏过程中挥发性盐基氮（TVB-N）值变化如表4所示。

表4 鱼片贮藏过程中的TVB-N值变化Table 4 Changes of TVB-N value in fish fillets during cold storage

TVB-N值是动物性食品在贮藏过程中，由于肌肉中细菌和内源性酶的相互作用，分解蛋白质而产生的氨、胺类等碱性含氮物质，可用于检测水产品的腐败变质程度[26]。根据GB2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品卫生标准》规定，淡水鱼类TVB-N值可食用限量为≤20mg/100g[27]，而TVB-N值≤12mg/100 g的鱼体可标示为一级鲜度[28]。如表4所示，随着冷藏时间的延长，各组生鱼片中的TVB-N值均逐渐增大，抗菌液中的TVB-N值上升速度明显低于对照组。对照组生鱼片冷藏第6天时的TVB-N值已接近20 mg/100 g，第7天的TVB-N值则达到21.30 mg/100 g，超过了国家食用标准。所有抗菌液组生鱼片冷藏第6天的TVBN值均小于11.5 mg/100 g，仍在一级鲜度范围内；冷藏第7天，高浓度芦苇叶、荷叶、溶菌酶抗菌液中的TVB-N值仍小于12 mg/100 g；冷藏9 d内，除低浓度槲叶组外，其他抗菌液组生鱼片的TVB-N值均未超过20 mg/100 g。由此可见，4种粽叶提取物可有效抑制鱼片中挥发性盐基氮的产生，可使TVB-N值的限量值延迟2d以上出现。其中，高浓度荷叶提取液对挥发性盐基氮的抑制效果明显高于其他粽叶，且与溶菌酶的效果相当，而高浓度芦苇叶、低浓度荷叶提取液对挥发性盐基氮的抑制效果则与壳聚糖相当。

童佩[20]利用10 mg/mL五倍子提取物浸泡草鱼，可使TVB-N值的限量值延迟2d出现。Dai等[23]利用2 g/L茶多酚浸泡鱼片，可使TVB-N值的限量值延迟2 d以上出现。李应洪等[29]利用50、100 mg/mL樟树叶多酚涂抹草鱼，可使TVB-N值的限量值延迟3 d～5 d出现。由此可见，不同植物提取物抑制草鱼TVB-N值的浓度有所差异，这可能是与植物中的抑菌活性成分组成与含量有关。

2.4 4种粽叶提取物对硫代巴比妥酸值的影响

草鱼片在冷藏过程中的硫代巴比妥酸（TBA）值变化如表5所示。

表5 鱼片贮藏过程中的TBA值变化Table 5 Changes of TBA value in fish fillets during cold storage

TBA值是测定肉类及水产品脂肪氧化酸败水平的指标，用于评判肉类和水产品脂肪的氧化酸败程度[30]。如表5所示，随着冷藏时间的延长，各组生鱼片中的TBA值均逐渐增大，抗菌液中的TBA值上升速度明显低于对照组。对照组的TBA值在冷藏第2天后快速上升，冷藏第9天的TBA值达1.11 mg/kg，抗菌液中的每日TBA值增幅量几乎均小于对照组。冷藏9 d内，低浓度槲叶、箬叶、芦苇叶抗菌液组生鱼片的TBA值接近，高浓度槲叶、箬叶抗菌液中的TBA值与壳聚糖组接近，高浓度芦苇叶抗菌液中的TBA值与溶菌酶组接近，两种浓度荷叶抗菌液对生鱼片的TBA值抑制效果最为明显。由此可见，4种粽叶提取物均能有效延缓草鱼片的TBA值上升，其中，荷叶、芦苇叶提取物的延缓效果较佳，而荷叶提取物对脂肪氧化的抑制作用超过了壳聚糖及溶菌酶，推测原因，可能是由于这几种粽叶中含有多种抗氧化活性成分，可以有效延缓鱼肉中的脂肪氧化[8-11]。

2.5 4种粽叶提取物对感官品质的影响

草鱼片在冷藏过程中的气味、颜色与质地变化如表6所示。

表6 鱼片贮藏过程中的感官指标的变化Table 6 Changes of sensory index in fish fillets during cold storage

续表6 鱼片贮藏过程中的感官指标的变化Continue table 6 Changes of sensory index in fish fillets during cold storage

由表6可知，随着冷藏时间的延长，各组生鱼片的感官品质逐渐下降，而对照组生鱼片的感官品质下降较快，与抗菌液组相比差异显著（P＜0.05），尤其是气味与质地。冷藏第1天时，所有组的生鱼片均有明显的新鲜鱼肉气味，无异味，有红色与白色肌肉色泽，肌肉致密，弹性恢复良好。冷藏第3天，除荷叶、壳聚糖、溶菌酶组外，其他组生鱼片开始失去鲜味；对照组和箬叶组的质地指标也开始下降。冷藏第7天，对照组、低浓度槲叶组生鱼片开始有腐败气味。除高浓度荷叶、溶菌酶组外，其他组生鱼片的肌肉开始松软，手指按压后无法恢复原形。由此可见，4种粽叶提取物可在不同程度上保持生鱼片的气味与质地，且高浓度时冷藏更有利。高浓度荷叶提取液对生鱼片气味、质地的改善效果最佳，其对质地的改善效果明显优于壳聚糖，对气味的改善则明显优于壳聚糖、溶菌酶（P＜0.05）。高浓度芦苇叶提取液对生鱼片气味、质地的改善与壳聚糖接近（P＞0.05）。

与气味、质地不同，4种粽叶提取物对生鱼片颜色的改善作用不及壳聚糖、溶菌酶，而且浓度提高时并未起到更好的效果，这可能是由于粽叶提取物溶液呈棕褐色，浓度越高颜色越深，因此在冷藏期内对生鱼片的颜色有一定影响。杨玲玲等[31]利用茶多酚延长鱼肉肠的货架期时，同样发现呈现黄褐色的茶多酚会造成鱼肉肠色泽的改变。

3 结论

利用荷叶、箬叶、芦苇叶、槲叶4种常见粽叶材料的多酚提取物溶液进行草鱼片保鲜，可有效抑制鱼肉中的微生物生长，控制鱼肉pH值的变化，延缓鱼肉中挥发性盐基氮的释放、硫代巴比妥酸值的变化，并保持生鱼片的感官品质，从而延长鱼肉的保质期。

荷叶提取物的抑菌效果明显优于其他粽叶，且荷叶、芦苇叶提取物的抑菌效果与壳聚糖、溶菌酶这两种天然抗菌剂相近，提高浓度可进一步增强4种粽叶提取物的抑菌作用。与不经处理的鱼肉相比，4种粽叶提取物可使生鱼片的pH值升高延缓2 d，芦苇叶提取物对pH值升高的控制效果与壳聚糖相近，荷叶提取物对pH值升高的控制效果则好于溶菌酶。4种粽叶提取物可使生鱼片的TVB-N限量值延迟2 d以上出现，荷叶提取物抑制挥发性盐基氮的效果明显高于其他粽叶，且高浓度荷叶提取液抑制挥发性盐基氮的效果与溶菌酶相当，而高浓度芦苇叶提取液的效果则与壳聚糖相当。荷叶、芦苇叶提取物延缓生鱼片TBA值上升的效果较佳，而荷叶提取物对脂肪氧化的抑制作用超过了壳聚糖、溶菌酶。荷叶提取物对生鱼片气味、质地的改善效果最佳，对质地的改善明显优于壳聚糖，对气味的改善明显优于壳聚糖、溶菌酶（P＜0.05），芦苇叶对生鱼片气味、质地的改善与壳聚糖接近（P＞0.05），但4种粽叶提取物对生鱼片颜色的改善作用不及壳聚糖、溶菌酶。由此可见，荷叶、箬叶、芦苇叶、槲叶的多酚提取物可有效延长草鱼片的保质期，它们是潜在的天然食品保鲜剂。