白藜芦醇对脂多糖刺激肉鸡生长性能和肠道屏障功能的影响

■李嘉辉 龚建刚 邹 俊 高新磊 张磊正 郝艳霜 冯志华* 赵国先

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2. 河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001）

肠道是动物进行营养消化吸收的重要场所[1]。随着世界范围内对畜产品需求的增加导致了放养密度的增加，使得动物更容易受到包括免疫应激在内的各种应激刺激，一些动物的肠道很容易受到感染[2]。肠道健康失衡后，动物对各类营养物质的利用受到负面影响，机体生长发育受到影响，使得养殖成本增加，造成不必要的经济损失[3]。应用健康绿色的饲料添加剂控制家畜的肠道功能和微生物环境被认为是提高生长性能和饲料效率的重要手段[4]。

白藜芦醇（3，4，5-trihydroxystilbene，RES）作为一种天然多酚化合物，具有抗氧化、抗炎和延缓机体衰老等众多生理功能[5-7]。Zhang 等[7]发现，日粮中添加400 mg/kg RES 可显著改善21～42 日龄肉鸡料重比。Ahmed等[8]报道，断奶仔猪中添加200 mg/kg RES 可通过提高免疫功能和营养物质消化率，促进仔猪生长。在反刍动物上的研究表明，日粮添加RES可改善血清抗氧化指标，显著增加犊牛体重[9]。此外，最近的研究表明，RES 在保护肠道健康方面有着积极作用。Mayangsari等[10]证实，RES可通过增加紧密连接蛋白在肠上皮细胞中的表达来促进肠道屏障的完整性。另外，据报道，RES 可通过缓解肠道黏膜损伤，提高肠道免疫、抗氧化功能及调节肠道内微生物菌群，发挥对肠道屏障功能的保护作用，缓解畜禽的多种应激[11-15]。而目前很少有关于RES 对免疫应激条件下肉鸡生长性能和肠道健康方面的研究。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，是先天免疫反应的有力激活剂，腹腔注射LPS 是构建动物免疫应激模型最常用的方法之一[16]。本研究通过LPS注射模拟肉鸡免疫应激模型，旨在探讨日粮添加RES 对LPS 刺激肉鸡生长性能、肠黏膜形态、黏膜二糖酶活性和肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

RES 购自西安瑞盈生物科技有限公司，纯度98%，白色粉末。LPS（血清型O55∶B5，L2880），来源于大肠杆菌，购自Sigma公司。

1.2 试验设计

采用2（是否LPS 刺激）×2（RES 添加量，0 或400 mg/kg）双因素随机分组设计，选用1 日龄健康体重相近[（42.20±0.30）g]的AA 肉公雏240 只，随机分为4 组，包括CON、RES、LPS 组和L-RES 组，每组6 个重复，每个重复（笼）10 只鸡。其中，CON 组和LPS 组饲喂基础日粮，RES 组和L-RES 组在基础日粮中添加400 mg/kg 的RES，RES 添加剂量参照之前的研究确定[17-18]。LPS组和L-RES 组肉鸡分别在16、18日龄和20 日龄早8：00 腹腔注射500 μg/kg BW LPS，其余两组肉鸡则注射等量的生理盐水（注射之前空腹12 h，断料不断水）。LPS 的给药途径和剂量参考Li 等[19]的研究。

1.3 基础日粮与饲养管理

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 检测指标和方法

1.4.1 生长性能

分别于1 日龄和21 日龄时对各重复试验鸡进行空腹称重，每日记录各重复采食量。试验结束后统计各组肉鸡1～21 日龄平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 十二指肠形态学指标和杯状细胞计数

21日龄时，每个重复选择1只接近整笼平均体重的健康肉鸡（空腹12 h），放血处死并解剖。迅速取十二指肠中段2 cm，于4%多聚甲醛中固定24 h后，进行常规脱水与石蜡包埋，5 μm厚度切片。苏木精-伊红染色（H.E.）后在40倍显微镜视野下观察，测量绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度比值，每张切片选取8 个良好的绒毛和隐窝进行测量，取“平均值”进行计算；使用高碘酸希夫式（PAS）染色，在400倍显微镜下观察，每张切片随机取5 个视野，统计每100 个肠上皮细胞中杯状细胞的数量，取平均值进行计算。

1.4.3 回肠黏膜二糖酶活性测定

对上述动物进行屠宰时，摘取回肠，无菌采取食糜于2 mL冻存管，置于液氮中速冻，备测回肠食糜菌群结构。使用生理盐水缓慢将回肠剩余食糜冲洗干净，随后用无菌载玻片刮取回肠黏膜，收集在2 mL 冻存管中，最后将回肠食糜和黏膜储存在-80 ℃冰箱待测。使用南京建成生物工程研究所有限公司的试剂盒测定肉鸡回肠黏膜中蔗糖酶和麦芽糖酶的活性，严格按照试剂盒说明书所示的试验条件和操作步骤进行测定。

1.4.4 回肠食糜微生物组成

根据TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（Illumina 公司）试剂盒构建文库，用特异性引物扩增16S rRNA 的V3～V4 区（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用TruSeq DNA PCR-样品制备试剂盒（Illumina 公司）生成测序文库。使用Illumina MiSeq 平台进行测序，文库制备和测序工作委托上海派森诺生物技术有限公司完成。

10.根据厂址区域的地形和工程具体条件，按电厂的规划容量作好发电厂的防排洪（涝）规划。充分利用现有防排洪（涝）设施；当必须新建时，经比选可因地制宜的采用防排洪（涝）堤、防排洪（涝）沟和挡水围墙等构筑物。防排洪（涝）设施应在初期工程中同步规划。同时要防止破坏山体，注意水土保持。

1.5 统计分析

数据采用SPSS 26.0 统计软件的一般线性模型（GLM）程序进行单因素方差分析，Duncan’s法进行多重比较。同时，对数据进行双因素方差分析，模型主效应包括LPS、RES 及两者的互作效应。试验结果均以“平均值±标准误”表示，P＜0.05 表示差异显著，0.05＜P＜0.10表示有趋势。

2 结果与分析

2.1 RES对LPS刺激肉鸡生长性能的影响

由表2可知，从主效应来看，LPS刺激显著降低了肉鸡1～21 日龄平均日增重和平均日采食量（P＜0.05），对料重比未产生显著影响（P＞0.05）；日粮添加RES 有提高肉鸡1～21 日龄平均日增重的趋势（P=0.081），对平均日采食量和料重比无显著影响（P＞0.05）。日粮添加RES 与LPS刺激对肉鸡生长性能无显著互作效应（P＞0.05）。由多重比较结果可知，应激状态下，RES可显著改善肉鸡平均日增重（P＜0.05）。

表2 RES对LPS刺激肉鸡1～21日龄生长性能的影响

2.2 RES 对LPS 刺激肉鸡十二指肠形态和杯状细胞数量的影响

由表3可知，从主效应来看，LPS刺激使肉鸡十二指肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度值和杯状细胞数量显著降低（P＜0.05），有提高隐窝深度的趋势（P=0.069）；日粮添加RES显著提高了肉鸡十二指肠绒毛高度/隐窝深度值和杯状细胞数量（P＜0.05）。由多重比较结果可知，非应激状态下，日粮RES的添加可显著提高肉鸡十二指肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值（P＜0.05）；应激状态下，RES可显著增加肉鸡十二指肠绒毛高度（P＜0.05）。

表3 RES对LPS刺激肉鸡十二指肠形态和杯状细胞数量的影响

2.3 RES对LPS刺激肉鸡回肠黏膜二糖酶活性的影响

由表4可知，从主效应来看，LPS刺激显著降低了肉鸡回肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性（P＜0.05），而日粮添加RES 使肉鸡回肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性显著提高（P＜0.05）。日粮添加RES 与LPS 刺激对回肠黏膜麦芽糖酶活性有显著的交互作用（P＜0.05）。由多重比较结果可知，非应激状态下，日粮RES 的添加可显著提高肉鸡回肠麦芽糖酶和蔗糖酶活性（P＜0.05）；应激状态下，日粮添加RES可显著提高肉鸡回肠麦芽糖酶活性（P＜0.05）。

表4 RES对LPS刺激肉鸡回肠黏膜二糖酶活性的影响（U/mg prot.）

2.4 RES对LPS刺激肉鸡回肠菌群的影响

2.4.1 RES对LPS刺激肉鸡回肠微生物多样性的影响由表5可知，从主效应来看，LPS刺激显著降低了回肠微生物OUT数量、Chao1和Shannon指数；日粮添加RES 有提高OUT 数量的趋势（P=0.075），并显著提高Chao1 指数（P＜0.05）。由多重比较结果可知，在应激状态下，日粮RES 的添加可显著提高肉鸡回肠Chao1指数（P＜0.05）。

表5 RES对LPS刺激肉鸡回肠微生物OUT数量及α多样性指数的影响

2.4.2 RES 对LPS 刺激肉鸡回肠菌群门水平相对丰度的影响

肉鸡回肠食糜门水平优势菌门主要是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。由表6 可知，从主效应来看，LPS 刺激显著降低了厚壁菌门相对丰度（P＜0.05），同时显著增加变形菌门的相对丰度（P＜0.05）。日粮添加RES 有提高厚壁菌门相对丰度的趋势（P=0.089），同时添加RES 使变形菌门相对丰度显著降低（P＜0.05）。日粮添加RES 与LPS 刺激对回肠食糜变形菌门相对丰度有显著的交互作用（P＜0.05）。由多重比较结果可知，在应激状态下，日粮RES 的添加显著降低了肉鸡回肠变形菌门的相对丰度（P＜0.05）。

表6 RES对LPS刺激肉鸡回肠菌群门水平相对丰度的影响

3 讨论

3.1 RES对LPS刺激肉鸡生长性能的影响

大量研究表明，肉鸡腹腔注射Lps会导致生长性能显著降低[19-23]。本研究也证实了LPS对肉鸡生长性能的负面影响，表现为平均日增重和平均日采食量显著下降，也提示本试验通过注射LPS构建的肉鸡免疫应激模型成功。LPS 导致的肉鸡生长性能受损可能与动物食欲降低、肠道屏障功能损伤及营养吸收被破坏有关[24-26]。马政等[27]发现，日粮添加500 mg/kg RES有提高肉鸡平均日增重和降低料重比的趋势。Zhang等[7]表明，400 mg/kg 剂量RES 可显著降低21～42 日龄科宝肉鸡料重比。本研究中，日粮RES 的添加有提高肉鸡1～21 日龄平均日增重的趋势，表明RES 对肉鸡生长性能有一定积极作用，这与上述研究结果相似。此外，本研究还发现，日粮添加RES 显著改善了LPS 刺激肉鸡的生长性能。张彩云[28]报道，日粮添加400 mg/kg RES可通过提高机体抗氧化能力和免疫功能显著改善LPS 刺激肉鸡的平均日增重和料重比。Zhang 等[29]报道，日粮添加400 mg/kg RES 类似物（紫檀芪）可保护肠道形态、减轻肠道炎症和黏膜损伤，缓解LPS 刺激肉鸡平均日增重。本研究显示，RES 对LPS刺激肉鸡生长性能的积极作用可能与其改善LPS刺激肉鸡肠道形态、肠黏膜二糖酶活性及肠道微生物屏障功能有关。

3.2 RES 对LPS 刺激肉鸡肠道形态和杯状细胞数量的影响

肠道的消化和吸收能力通常通过绒毛高度、隐窝深度和绒隐比指标来反映[30]。肠道上皮被杯状细胞分泌的黏液覆盖，可保护肠黏膜免受病原体和毒素的攻击，因此，杯状细胞对于肠黏膜屏障功能十分重要[17]。本研究中，腹腔注射LPS 造成了肉鸡肠黏膜屏障的损伤，表现为十二指肠绒毛高度、绒隐比和杯状细胞数量显著降低，这与之前的研究结果基本一致[19-20，31]。Gan等[32]发现，在断奶仔猪日粮中添加RES可显著提高空肠及回肠绒毛高度。Qiu 等[14]研究表明，日粮添加RES可显著提高断奶仔猪空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值，并显著提高空肠杯状细胞数量。与以上研究类似，本研究中，日粮补充RES 有提高肉鸡十二指肠绒毛高度的趋势，并显著增加十二指肠绒隐比和杯状细胞数量。以往的研究表明，日粮添加植物提取物可显著缓解LPS刺激引起的动物肠道形态受损[33-34]。本研究中，RES 显著提高了LPS 刺激肉鸡肠道绒毛高度，表明RES 可在一定程度上减轻LPS诱导的肠道损伤，保护肠道形态。

3.3 RES 对LPS 刺激肉鸡肠道黏膜二糖酶活性的影响

食物中的二糖不能被小肠直接吸收，肠黏膜二糖酶（如麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等）在动物对碳水化合物的吸收中起着不可或缺的作用[35]。二糖酶活性的高低可反映肠道上皮细胞的发育程度和功能强弱[36]。研究表明，LPS 可导致动物肠道二糖酶活性显著降低[37-38]。本研究也证实，在LPS刺激下，肉鸡回肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性显著降低，这表明LPS刺激对肠道的消化吸收功能产生损伤。与未添加RES相比，日粮补充RES 显著提高了肉鸡回肠麦芽糖酶和蔗糖酶活性，这与Cheng 等[39]在小鼠上的研究一致。Gan等[32]表明，RES 可显著提高断奶仔猪回肠麦芽糖酶活性。此外，本研究发现，添加RES 显著缓解了LPS 引起的肉鸡回肠麦芽糖酶活性的降低，这与前面提到的RES 改善LPS 刺激肉鸡肠道形态的结果一致。有研究表明，保持肠道形态结构的完整性，更有利于黏膜二糖酶的分泌，进而更好地消化和吸收日粮中的养分，提高动物生长性能。

3.4 RES对LPS刺激肉鸡回肠菌群的影响

肠道微生物菌群在抑制病原体感染和调节营养消化吸收等方面发挥着重要作用，肠道菌群的平衡有利于保持动物机体的健康[40]。本研究使用16S rRNA测序检测了肉鸡回肠食糜微生物群落的多样性和组成。通过Chao1 和Shannon 指数等α多样性指标来评价回肠菌群的物种多样性。OUT 数量能够反映肠道菌群中物种的量[41]。本研究中，LPS 刺激显著降低肉鸡回肠微生物OUT数量、Chao1指数和Shannon指数，表明LPS 刺激使肉鸡肠道微生物群落多样性降低。而日粮添加RES 显著提高了LPS 刺激肉鸡回肠微生物Chao1指数，表明RES有助于维持肠道菌群的多样性。Song 等[42]发现，RES 可提高环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠Chao1 指数和Shannon 指数，证实了RES 对肠道菌群多样性的积极作用。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是肉鸡回肠微生物区系中主要的优势菌门，这与之前的研究结果一致[43-44]。厚壁菌门与碳水化合物的代谢及纤维分解有关[45]，拟杆菌门能够降解非纤维性碳水化合物及蛋白质，促进胃肠道免疫系统发育[46-47]。而变形菌门中有许多病原微生物（如幽门螺杆菌和沙门氏菌等），变形菌的增加是菌群失调的一个标志[48-49]。LPS刺激显著降低了肉鸡肠道中厚壁菌门相对丰度，同时显著提高了变形菌门相对丰度，打破了肠道菌群的平衡状态。而日粮补充RES显著缓解了由LPS 刺激引起的肉鸡肠道变形菌门相对丰度的增加。表明RES 可通过减少肉鸡肠道变形菌数量，在一定程度上缓解由LPS 刺激引起的菌群失调，改善免疫应激肉鸡的微生物菌群紊乱。

4 结论

日粮中添加400 mg/kg能够提高肉鸡生长性能并改善肠道屏障功能，在一定程度缓解LPS引起的免疫应激。