饲用凝结芽孢杆菌的菌数检测方法研究进展

2023-03-06黄遵锡王雪艳程志斌

饲料工业 2023年3期

■黄遵锡王雪艳程志斌

(1.云南师范大学生命科学学院，云南昆明 650222；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是革兰氏阳性、硬壁菌门、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属细菌，抗逆性好[1-3]，同时凝结芽孢杆菌分泌抗菌肽（蛋白）、乳酸等抑菌物质[4-6]。因此，饲用凝结芽孢杆菌作为我国饲料工业禁抗形式下的功能性饲用益生菌之一，满足了颗粒饲料制粒工艺及畜禽良好生产性能的需求[7-8]。大量综述及动物饲养试验表明，畜禽生产性能的改善与饲粮中凝结芽孢杆菌的添加量有关[9-13]，因此饲用凝结芽孢杆菌产品菌数检测的真实性和准确性备受生产企业及应用企业的关注。

当前，饲用凝结芽孢杆菌产品菌数检测的规范方法为细菌平板计数法（aerobic plate count method），云南省标准化协会颁布的团体标准《饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定》（T/YNBX 024—2021，简称“云南团体标准”）[14]、北京生物饲料产业技术创新战略联盟颁布的团体标准《饲料添加剂凝结芽孢杆菌》（T/CSWSL 022—2020，简称“北京团体标准”）[15]及辽宁省地方标准《饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测》（DB21/T 3278—2020）[16]均采用该方法。对比以上三个标准中的检测方法，发现不同标准之间对饲用凝结芽孢杆菌菌数检测的基本概念及具体的操作步骤存在明显差异。据此，本文详述了检测的操作差异及其对菌数检测结果的影响，为科学、准确地检测饲用凝结芽孢杆菌的菌数提供参考。

1 饲用凝结芽孢杆菌产品及其菌数检测的基本概念

与其他芽孢杆菌属饲用益生菌一样，工业发酵生产的凝结芽孢杆菌原粉中主要包括芽孢化的凝结芽孢杆菌（简称“芽孢”）及少量未芽孢化的凝结芽孢杆菌活菌（简称“活菌”）。依据生产应用的需求，将凝结芽孢杆菌原粉添加一定比例的载体或（和）其他商业饲用益生菌，最终形成饲用凝结芽孢杆菌产品。借鉴国家标准《微生物饲料添加剂通用要求》（GB/T 23181—2008）[17]对微生物饲料添加剂的规范描述，本文定义了饲用凝结芽孢杆菌产品的两种类型：①单一饲用凝结芽孢杆菌产品（Bacillus coagulansfeed additive）：产品中的唯一“功能菌”（functional microorganism）是凝结芽孢杆菌；②复合饲用凝结芽孢杆菌产品（mixed feed additive ofBacillus coagulansand other probiotics）：多个功能菌组合的产品，且凝结芽孢杆菌菌数占比大于1%。这一指标基于GB/T 23181—2018[17]对产品“杂菌”（nontarget microorganisms）的描述，有助于两种类型饲用凝结芽孢杆菌产品的标识及质量检测。

当前，现有标准均采用平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌的菌数，其检测原理是将待检样品和（或）盲样中的功能菌接种到特定琼脂培养基上，一定时间内单个菌体细胞在培养基上长成肉眼可见的菌，通过特征菌落的辨识及菌落计数（CFU/g），定量产品中的凝结芽孢杆菌及可能的其他菌[18]。鉴于待检样品或盲样可能是单一或复合饲用凝结芽孢杆菌，且产品的功能菌存在芽孢和活菌等多种形式，再加上载体及稀释工艺可能污染的杂菌，因此饲用凝结芽孢杆菌产品菌数的检测应包括3个指标：①芽孢数（spore count）：产品中以芽孢形式存在的凝结芽孢杆菌；②总菌数（total aerobic count）：产品中凝结芽孢杆菌的芽孢和活菌的总数；③杂菌数（nontarget microorganism count）：产品中占比小于1%的非功能菌。据此，饲用凝结芽孢杆菌产品“芽孢率”的计算基于芽孢数除以总菌数的百分比；饲用凝结芽孢杆菌产品“杂菌率”的计算基于杂菌数除以总菌数与杂菌数之和的百分比。

由于发酵生产的凝结芽孢杆菌原粉及稀释的饲用凝结芽孢杆菌产品包含凝结芽孢杆菌的芽孢和活菌，因此凝结芽孢杆菌生产企业一般只标识产品的总菌数。然而，除蛋鸡粉料无需制粒加工外，饲用凝结芽孢杆菌产品在大部分颗粒料中的耐热性评估，是指制粒后颗粒料中凝结芽孢杆菌的有效芽孢数及存留率[19-20]。因此，饲用凝结芽孢杆菌的芽孢数更受到饲料生产及养殖应用企业的关注。此外，产品杂菌及杂菌率严重影响产品质量及应用效果，饲用凝结芽孢杆菌生产企业、应用企业均需严格把控杂菌的检测。

2 平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌菌数的概述

图1 和图2 分别描述了云南团体标准、北京团体标准采用平板计数法对饲用凝结芽孢杆菌产品总菌数、芽孢数及杂菌数的检测。由于辽宁省地方标准DB21/T 3728—2020与北京团体标准的检测程序与操作相同，本文后续重点比较云南团体标准、北京团体标准对饲用凝结芽孢杆菌菌数检测的差异。

两个团体标准中相似的基本检测程序，包括：取样、样品菌悬液制备、梯度稀释、接种、培养、计数（见图1 和图2）。然而，与云南团体标准相比，北京团体标准多了样品“菌悬液热处理”步骤（见图2）。热处理操作参数为80 ℃水浴10 min，与标准《饲料中饲用芽孢杆菌的测定》（DB32/T 2583—2013）[21]的芽孢数检测参数一致。由于热处理已杀灭活菌，因此北京团体标准检测的是饲用凝结芽孢杆菌产品的芽孢数（见图2），同时已无法计数产品的总菌数及计算产品的芽孢率。进一步分析图1，未采用热处理操作的云南团体标准，检测的是产品中凝结芽孢杆菌的总菌数（包括芽孢和活菌）。诚然，云南团体标准不能定量饲用凝结芽孢杆菌产品的芽孢数及芽孢率。

图1 云南团体标准（T/YNBX 024—2021）中饲用凝结芽孢杆菌菌数的检测程序

图2 北京团体标准（T/CSWSL 022—2020）中饲用凝结芽孢杆菌菌数的检测程序

此外，就产品杂菌检测而言，尽管云南团体标准进行了杂菌检测的描述（见图1），但认为无法准确计数。主要原因包括：其一，缺失杂菌菌落识别步骤。杂菌的定义是产品中占比小于1%的非功能菌，检测操作中应强调杂菌菌落形态的观察及识别，但云南团体标准未详细描述，建议借鉴国家标准《农用微生物菌剂》（GB 20287—2006）[17]中操作步骤“6.3.2.3 菌落识别”进行完善。其二，杂菌的培养基应用失误。受发酵工艺、产品设计及加工过程等诸多因素影响，产品中的杂菌可能复杂、多样。依据云南团体标准描述的杂菌检测程序中操作步骤“6.4.2 培养基”，杂菌的检测培养基与总菌数的检测培养基完全相同显然不可行。诚然，基于平板计数法检测饲用益生菌产品中的杂菌一直是个难题。在识别杂菌菌落形态的基础上，借鉴标准《水产微生态制剂解淀粉芽孢杆菌生产技术规程》（DB12/T 863—2019）[23]操作步骤“6.4 杂菌率的测定”中杂菌分类检测（如好氧杂菌、厌氧杂菌）的思路，可实现检测方法的完善。

3 平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌菌数的操作差异

尽管两个团体标准对凝结芽孢杆菌菌数检测的检测程序相似（包括取样、样品菌悬液制备、梯度稀释、接种、培养、计数等）。然而，具体的操作存在差异，分析见表1。

表1 两个团体标准在饲用凝结芽孢杆菌菌数检测中的操作差异

3.1 培养基

营养底物（培养基组分及含量）及环境pH（液体培养基pH）是细菌正常生长的重要条件[24-25]，因此选用培养基对检测凝结芽孢杆菌十分关键。就凝结芽孢杆菌检测的琼脂培养基而言，云南团体标准与北京团体标准有一定差异。

3.1.1 培养基的营养组分及含量差异

云南团体标准与北京团体标准中凝结芽孢杆菌检测的琼脂培养基共有营养组分包括蛋白胨、半胱氨酸盐酸盐、酵母膏（粉）、葡萄糖、硫酸锰、琼脂。已有文献显示，这些营养组分是凝结芽孢杆菌增生、增殖的重要氮源、碳源及矿物质营养，适合凝结芽孢杆菌培养[26-29]。此外，云南团体标准的培养基特有成分，包括番茄粉、牛肉膏、氯化钠、无水氯化钙。番茄粉常用于嗜酸性细菌培养基，能够显著促进乳酸菌类细胞的增生、增殖[25]；牛肉膏的应用是在蛋白胨基础上进一步增强凝结芽孢杆菌培养所需的氮源。因此，云南团体标准的凝结芽孢杆菌检测培养基强化了细胞生长的营养需求。

北京团体标准的凝结芽孢杆菌检测培养基特有成分包括溴甲酚紫、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁。与云南团体标准相比，北京团体标准的检测培养基强化了凝结芽孢杆菌生长所需的矿物质营养。更重要的是，鉴于溴甲酚紫在酸性条件显示黄色、碱性环境下显示紫色[25，27]，显然北京团体标准倾向于采用凝结芽孢杆菌的“选择性培养基”，以便通过显色增强凝结芽孢杆菌特征菌落的辨识及计数，并区别待检样品中的杂菌及可能的其他功能菌。这无疑提高了盲检样品的准确性，也方便检测人员的操作，尤其是对凝结芽孢杆菌检测熟悉度不高的检测人员[27]。

另外，进一步对比培养基中营养组分的含量，云南团体标准的营养组分占比为4.19%，北京团体标准的营养组分占比为1.56%，有明显差异。

3.1.2 培养基初始pH的可能差异

大量试验研究及综述报道显示，中性偏酸环境（pH 5.5～6.5）是凝结芽孢杆菌适合的生长条件[1，6，27-28]。基于上述两个团体标准中凝结芽孢杆菌检测培养基的营养组分及含量差异，尤其是番茄粉等特有成分的使用，笔者推测：云南团体标准的培养基初始pH低于北京团体标准，更适合凝结芽孢杆菌的生长及培养，有利于菌数检测的准确性。

3.1.3 培养基调整pH的差异

基于培养基初始pH可能影响凝结芽孢杆菌菌数检测的准确性，两个标准均对培养基pH进行了调整，云南团体标准调整的培养基pH为5.2，北京团体标准调整的培养基pH 为5.5。尽管调整后的pH 相近，但结合培养基差异化的营养组分及含量，其是否影响饲用凝结芽孢杆菌菌数的检测有待于进一步试验验证。

3.2 稀释液

检测程序中提前准备的稀释液（见图1 和图2），用于制备样品菌悬液及梯度稀释操作。稀释液的主要功效是尽可能地保障菌悬液中凝结芽孢杆菌的分散程度，实现平板上呈现分散清晰的菌落，以便菌落计数。与北京团体标准相比，云南团体标准的稀释液增加了“吐温-80（聚山梨醇酯-80）”。吐温-80 是一种非离子型表面活性剂，作为一种高效分散剂常用于细菌检测，有利于菌数检测的准确性[30]。显然，云南团体标准强化了凝结芽孢杆菌检测中稀释液的功效。

3.3 检测操作

3.3.1 取样差异

北京团体标准的取样操作为将25 g 样品加入225 mL 稀释液中，样品稀释10%，这与国家标准《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》（GB/T 26428—2020）[31]一致。云南团体标准为将1 g样品加入100 mL 稀释液中，稀释了1%。显然，两个标准的取样操作具有一定差异。基于实际生产与应用中往往对样品（高菌数的凝结芽孢杆菌原粉、低菌数的饲用凝结芽孢杆菌产品）进行盲检，取样方式的差异显然会影响后续检测步骤“菌悬液的梯度稀释”。

3.3.2 样品菌悬液制备（均质）差异

两个团体标准的样品菌悬液制备，均采用了摇床均质法。均质是细菌菌数检测过程中的重要步骤之一，目的是将样品与稀释液充分混合，制备样品菌悬液。摇床规律振荡促使样品中的细菌在稀释液中分散均匀，起到均质作用[32]。云南团体标准中摇床振荡参数为220 r/min、振荡30 min，北京团体标准中摇床振荡参数为185 r/min、振荡60 min。涂家霖等[32]研究显示，摇床转速显著影响凝结芽孢杆菌的生长。云南团体标准采用“高速、短时”摇床均质，北京团体标准采用“低速、长时”摇床均质，这一差异对饲用凝结芽孢杆菌菌数检测的影响有待评估。

此外，也有借助设备无菌均质器、均质样品检测凝结芽孢杆菌菌数的报道[33]。通过无菌均质器的拍打实现样品菌悬液的均质，拍打频率为3～12 次/s，时间为1～10 min。

3.3.3 菌悬液热处理差异

云南团体标准无菌悬液热处理操作，北京团体标准多了菌悬液热处理操作，即80 ℃水浴处理10 min，这是两个团体标准之间最大的差异。鉴于盲检样品含有凝结芽孢杆菌的芽孢和活菌、可能的杂菌以及其他功能菌（复合益生菌产品），笔者对菌悬液热处理操作的观点如下：其一，若样品中只含单一凝结芽孢杆菌，菌悬液热处理后实测的是凝结芽孢杆菌的芽孢数，而不是总菌数；其二，若样品中含高比例杂菌，且杂菌不耐热（如大肠杆菌、酵母菌），热处理操作可能误判样品杂菌及杂菌率。据此，若采用北京团体标准判定饲用凝结芽孢杆菌产品的质量，杂菌判定可能存在误判的风险，这恰恰是饲料及养殖应用企业需要警惕的关键。

3.3.4 接种操作差异

涂布法（spread plate method）和倾注法（pour plate method）是细菌检测的常用接种操作法，均为了实现单个细胞在固体培养基上形成肉眼可见的清晰菌落，以便后续平板计数的准确性[34-36]。云南团体标准的接种法为倾注法，而北京团体标准的接种法为涂布法。

涂布法和倾注法在饲用凝结芽孢杆菌菌数检测中各有优缺点。涂布法的优点是菌落生长在培养基表面，易观察计数；且操作简单，对检测人员的熟练度要求不高。涂布法的缺点是需要借助涂布器操作，涂布器在操作过程中会不可避免地粘连少量待检细菌，理论上造成检测值低于真实值[34]。相反，倾注法将稀释菌液直接倒入培养基，避免了涂布器粘连的问题。因此，理论上倾注法较涂布法的检测结果更准确[35]。然而，倾注法的缺点是对检测人员操作熟练度的要求较高，因为倾注法导致大量菌体镶嵌在培养基内，增加了菌落辨识与计数的难度[36]。据此，建议根据实际操作情况选用适合的接种法。

3.3.5 培养差异

培养操作的关键是培养温度与培养时间，且两者相关性较强。众所周知，温度是细菌增殖、增生的重要条件之一[24-25]。大量研究与综述显示，凝结芽孢杆菌在35～50 ℃环境温度中均能生长[1，27-28，37]。然而，就凝结芽孢杆菌检测的培养条件而言，温度范围过于宽泛，不利于检测的准确性。这一问题也反映在现有的两个团体标准中。云南团体标准的培养温度为40 ℃，培养时间为48 h；北京团体标准的培养温度为50 ℃，培养时间为24 h，存在较大差异。

当前，有关培养温度与培养时间对凝结芽孢杆菌检测菌数影响的试验研究较少，且报道结果存在差异。单春乔等[27]以平板观察到的菌落数量、大小、分散程度等为指标，研究了多个培养温度（37、42、45、50 ℃）及培养时间（24、36 h）对凝结芽孢杆菌菌数检测结果的影响，研究显示凝结芽孢杆菌菌数检测的最佳培养温度为50 ℃，培养时间为24 h。徐丽等[38]描述的饲用凝结芽孢杆菌检测培养温度为45～50 ℃，培养时间为24～48 h。薛志清等[39]专利文献中饲用凝结芽孢杆菌检测培养温度为45～55 ℃，培养时间为22～26 h。以上分析提示，饲用凝结芽孢杆菌菌数检测的适合培养温度与培养时间值得进一步试验确定。