多效唑纳米微球悬浮液的制备及性质研究

石文慧，王晓艳，李世卿，侯福鼎，张小军，李姝静

(1.北京工商大学 化学与材料工程学院，北京 100048；2.福建诺德生物科技有限责任公司，福建 三明 365300; 3.中农立华生物科技股份有限公司，北京 100052)

农药在现代农业的作物生长管理中发挥着重要作用［1］。然而，由于飘移、被雨水冲刷到环境中，传统配方的农药有效利用率不到1%［2-3］。为了达到更好的防治效果，农药不得不超量使用，这对田间生态系统和人体健康造成了威胁。与传统农药剂型相比，纳米农药可以增强农药在作物叶片表面的附着力和铺展性，提高利用率，同时降低环境污染风险。因此，开发一种具有铺展性的缓释纳米农药是提高农药利用率的一种很有前景的方法［4-5］。

玉米醇溶蛋白(zein)具有两亲性质，生物相容性好，安全无毒［6］。由于拥有多肽结构，还具有易降解的优点，对环境友好。此外，玉米醇溶蛋白在醇的水溶液中可以自组装形成纳米微球，包埋疏水性分子实现可控释放，是传递物质的理想载体［7］。但是玉米醇溶蛋白中疏水基团较多，水溶性较差，难以提高负载分子的利用率。

壳聚糖(chitosan，CS)是地球上最常见的丰富的天然多糖，主要来源为甲壳类动物的外部骨骼以及某些细菌和真菌的细胞壁中提取的几丁质脱乙酰化产生［8］。壳聚糖具有优异的生物官能性、生物相容性、无毒、抗菌性和生物降解性［9］，是食品、药品、生化和农业领域合成控释系统的首选材料。有研究表明，壳聚糖是玉米醇溶蛋白微球的一种优良的稳定剂，可提高微球的稳定性［10］。

多效唑(paclobutrazol，PBZ)是一种高效低毒的植物生长调节剂，属于含氮杂环化合物中的三唑类化合物［11］。多效唑能够延缓植物生长，抑制茎的伸长，延缓植物衰老等生理效应［12］，但是多效唑微溶于水，实际使用率低，限制了其应用。

由于具有清洁、高效和环保的优点，静电自组装是制备纳米材料的重要方法。Zein 与CS 之间存在氢键、静电等相互作用力。静电自组装是将2 个带有相反电荷的聚电解质，通过静电相互作用，以吸附的方式形成纳米级微球，所形成的微球具有结合强度高、稳定等优点。Zein 具有较高的负电荷密度，可以在自组装过程中提供阴离子组分，而CS作为一种阳离子聚电解质，能够通过静电、氢键、疏水等作用力与zein 形成纳米微球。在本研究中，zein 是PBZ 的载体，无水碳酸钠为牺牲模板，当zein-无水碳酸钠乙醇溶液加入水中时，无水碳酸钠扩散，通过反溶剂沉淀形成zein 纳米微球，PBZ 可以由无水碳酸钠留下的通道进入zein，CS 以静电自组装的方法与zein 结合，形成负载多效唑的纳米微球。因此，本研究通过静电自组装制备了负载多效唑的壳聚糖/玉米醇溶蛋白纳米微球(CS/zein-PBZ)后，考察了CS 与zein 质量比对空白纳米微球以及载多效唑纳米微球的粒径、多分散指数(PDI)和zeta 电位的影响，以及对比了不同壳聚糖和玉米醇溶蛋白质量比和不同壳聚糖浓度下的载药量，表征了多效唑纳米微球的结构、稳定性和缓释性能，以期揭示其释放机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖(摩尔质量为1.15×106g/mol，脱乙酰度为81.63%，阿拉丁有限公司)；玉米醇溶蛋白(92%，上海源叶生物有限公司)；多效唑(摩尔质量为291.78 g/mol，上海源叶生物有限公司)；15%多效唑可湿性粉剂(市售)；无水碳酸钠(分析纯，麦克林有限公司)；无水乙醇(分析纯，GENERAL-REAGENT)；冰乙酸、甲醇、磷酸盐缓冲液［分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司］。

1.2 设备与仪器

N-1100V-W(WD)旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；C-MAG HS 7 磁力搅拌器(德国IKA 公司)；JSM 6700F 扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；Cary-50UV-vis 紫外可见分光光度计(美国Varian 公司)；Zetasizer Nano ZS90 粒径分析仪(英国Malvem 公司)；DSA-100 接触角测试仪(德国KRUSS 公司)；UltiMate3000高效液相色谱(中国赛默飞世尔科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 CS/zein 纳米微球的制备

参照Khan 等［13］的方法制备了CS/zein 空白纳米微球。称取0.5 g 的玉米醇溶蛋白粉末溶于10 mL 70%的乙醇水溶液中，配制成质量浓度为5% 的玉米醇溶蛋白溶液。称取0.1 g 的无水碳酸钠溶于10 mL的去离子水，配制成质量浓度为1% 的无水碳酸钠溶液。将1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液加入到0.3 mL无水碳酸钠与0.7 mL 无水乙醇的混合液中，再将玉米醇溶蛋白和无水碳酸钠混合液逐滴加到8 mL 去离子水中，持续搅拌10 min 后，分别逐滴滴加到10 mL壳聚糖质量浓度为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1% 的1%乙酸溶液中，室温下搅拌30 min，得到CS/zein 纳米微球。

1.3.2 CS/zein-PBZ 纳米微球的制备

分别称取5、10、15、20 mg 的多效唑溶于1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液，加入到0.3 mL 无水碳酸钠溶液和0.7 mL 无水乙醇混合液中。然后逐滴滴加到8 mL 去离子水中，持续搅拌10 min 后，滴加到0.02%~0.1%的壳聚糖溶液中，室温搅拌30 min，得到CS/zein-PBZ 纳米微球悬浮液。

1.3.3 SEM 观察

将试样进行稀释，滴在处理好的硅片上，在室温中干燥8 h，表面作喷金处理后，放入电镜室以观察试样形貌，加速电压是5.0 kV。用Nano Measurer 1.2 软件标注纳米微球的直径后，统计计算微球的直径分布图。

1.3.4 动态光散射(DLS)

用散射角为90°的Zetasizer Nano ZS90，在25 ℃下通过动态光散射测量微球大小、多分散指数和zeta 电位。

1.3.5 标准曲线的绘制

准确称取适量多效唑，定容后在200~800 nm 波长范围内对试样进行紫外扫描，考察试样的紫外吸收情况，以最大吸收波长为多效唑的检测波长。色谱柱为Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.3%(质量分数)磷酸盐缓冲液(pH=3，90∶10)。检测波长267 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。将试样分别稀释至不同浓度，按照所述的色谱条件进样，记录相应的峰面积。以进样浓度为横坐标，PBZ 峰面积为纵坐标进行线性回归，得到PBZ 标准曲线。

1.3.6 包埋率和载药量

包埋率(encapsulation efficiency)是指多效唑纳米微球中包裹多效唑的质量与多效唑的投入量的比，载药量(loading efficiency)是指多效唑占多效唑纳米微球的比重。将制备好的试样用离心机在6 000 r/min 下离心10 min，取上清液通过高效液相色谱法得到多效唑含量。通过标准曲线计算多效唑的浓度，根据公式⑴、⑵计算包埋率和载药量。

2 结果与分析

1.3.7 接触角

室温下，用接触角测试仪测定了多效唑可湿性粉剂悬浮液和多效唑纳米微球悬浮液的润湿性能。将稀释一定倍数的试样滴在Parafilm 载玻片上。液滴形态的变化被数字化捕捉5 min，每个试样测试3 次，使用五点拟合分析法计算了左右侧接触角的平均值。

1.3.8 缓释性能研究

通过透析袋法［14］研究了纳米微球中多效唑的缓释性能，释放介质为乙醇/水(1∶1，体积比)。将具有相同有效含量的多效唑试样连同释放介质一起转移到透析袋(MWCO，500D)中，将透析袋放入装有释放介质的烧杯中。在特定的时间间隔内，收集3 mL试样，并迅速用相同体积的新鲜释放介质代替，用紫外可见分光光度计测量吸光度3 次。多效唑的累积释放率通过公式⑶计算：

式中：Ct为在t时取出的试样浓度，mg/mL；Vt-1(3 mL)为在t-1 时取出的试样体积；V(100 mL)为初始溶液体积；w为透析袋中多效唑的质量，mg。

2.1 DLS 和储存稳定性

如图1 所示，当溶液中玉米醇溶蛋白的含量不变时，壳聚糖的浓度增加，CS/zein 纳米微球的粒径也随之增加，这可能是因为能够包裹玉米醇溶蛋白的壳聚糖的量增加，从而导致粒径有所增加。PDI可以用来证明纳米微球的均一性，其数值越小代表试样的均一性越好。PDI 的数值均在0.3 以下，表明CS/zein 纳米微球具有良好的分散性。当zeta 电位的绝对值大于30 mV 时，可认为纳米微球的体系是具有一定稳定性的，绝对值越大，体系的稳定性越高。CS/zein 纳米微球的zeta 电位均大于65 mV，表明体系具有较高的稳定性。在热贮(54 ℃)条件下储存了14 d 后，微球粒径没有明显变化，PDI 小于0.3，表明微球具有一定的储存稳定性。随着壳聚糖的加入量增加，体系依旧能够保持良好的稳定性，CS/zein纳米微球的粒径基本保持不变。这是由于CS 具有高电荷密度，当CS 的加入量逐渐增加时，CS 能与带负电荷的zein 紧密交联。此外，纳米微球由于CS的加入所带有的正电荷与游离的CS 之间存在静电排斥，静电斥力的存在可以防止纳米微球过度团聚形成沉淀，对溶液的稳定性有积极的影响。

图1 壳聚糖的浓度对CS/zein 纳米微球的粒径(A)、PDI(B)和zeta 电位(C)的影响

如图2 所示，CS/zein-PBZ 纳米微球，在加入了不同质量的多效唑后，平均粒径也随之变化，与CS/zein 纳米微球相比，PDI 的值也有所增加，这说明多效唑的加入会影响纳米微球的颗粒大小和体系的均一性，同样具有较高的zeta 电位，说明加入多效唑以后，纳米微球也具有很好的稳定性。

图2 壳聚糖的浓度对CS/zein-PBZ 纳米微球的粒径(A)、PDI(B)和zeta 电位(C)的影响

如图3 所示，当多效唑的投入量分别为5、10、15、20 mg 时，CS/zein-PBZ 纳米微球的粒径都随着壳聚糖浓度的增加而增加，在热贮(54 ℃)条件下经过14 d 保存以后，其粒径的变化不大，说明此方法制备的CS/zein-PBZ 纳米微球具有良好的稳定性。此外，都具有较低的多分散性，当多效唑的投入量为20 mg 时，纳米微球的PDI 都在0.3 以下，说明多效唑在此浓度下的纳米微球均一性最好。

图3 CS/zein-PBZ 纳米微球的粒径与PDI 随壳聚糖浓度和储存时间的变化

2.2 多效唑的包埋率和载药量

如图4 所示，当投入多效唑的质量为5 mg 时，包埋率随壳聚糖的浓度总体上呈先减小后增大的趋势，投入多效唑的质量为10、15、20 mg 时，包埋率随壳聚糖的浓度呈增大的趋势。壳聚糖浓度为0.1%时，多效唑的包埋率均高于同等质量多效唑其他壳聚糖浓度的，且在多效唑为20 mg 时达到最高，为89.9%，说明此时对多效唑的包埋效果最好。多效唑的包埋率和载药量均随着多效唑浓度的增加而增加，与包埋率不同的是，随着壳聚糖浓度的增加，载药量整体呈下降的趋势。

图4 CS/zein-PBZ 纳米微球的包埋率(A)和载药量(B)随壳聚糖浓度的变化

在多效唑为20 mg 时CS/zein-PBZ 纳米微球均具有较高的载药量，壳聚糖浓度为0.1%时达到最大。考虑到纳米微球的稳定性和均一性，壳聚糖的浓度为0.1%，多效唑为20 mg 时的CS/zein-PBZ 纳米微球具有最优的表现，包埋率和载药量分别为89.9%和28.8%，因此选用此纳米微球进行后续的表征。

2.3 纳米粒子的形态学观察

如图5 所示，CS/zein 纳米微球和CS/zein-PBZ纳米微球的扫描电子显微镜图像呈球形，微球表面光滑，多效唑的加入并没有改变CS/zein NPs 的形态。CS/zein 和CS/zein-PBZ 纳米微球的平均粒径分别是(186.94±46.16)、(175.69±33.22)nm，这一结果小于通过激光粒度仪所测得的平均粒径。这可能是因为激光粒度仪是在溶液中测量微球的粒径，这种情况下测得的是水合粒径，而扫描电子显微镜的数据是在试样被自然风干以后得到的，因此小于激光粒度仪所测得的纳米微球的粒径。这一结果与李等［15］报道的负载姜黄素的玉米醇溶蛋白-壳聚糖纳米微球的结果类似。

图5 CS/zein 纳米微球(A、B)和CS/zein-PBZ 纳米微球(C、D)的扫描电子显微镜图和粒径分布图

2.4 多效唑的铺展性能研究

良好的铺展性可以减少液滴的滑落，有效降低农药的损失。其铺展性能可以由液滴的静态接触角大小来反映。如图6 所示，多效唑可湿性粉剂和CS/zein-PBZ 纳米微球悬浮液的接触角分别为68.3°±2.36°和60.2°±2.22°。在多效唑有效含量相同的情况下，与多效唑可湿性粉剂直接分散到水中相比，经过玉米醇溶蛋白和壳聚糖包裹的多效唑纳米微球悬浮液具有更好的铺展性，证明了所制备的CS/zein-PBZ 纳米微球可以提高多效唑的润湿性。

图6 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 纳米微球的接触角

2.5 多效唑的释放性能研究

具有缓释性的农药可以减少农药用量，提高施用效率，解决农药的过度使用问题，减少环境污染。因此，探究了CS/zein-PBZ 纳米微球的释放性能，选用壳聚糖浓度为0.1%，多效唑为20 mg 时的CS/zein-PBZ 纳米微球试样，该试样的包埋率和载药量分别为89.9%和28.8%。多效唑可湿性粉剂和CS/zein-PBZ 纳米微球的释放如图7 所示，游离的多效唑在前4 h 保持较高的释放速率，在12 h 释放完成。而CS/zein-PBZ 纳米微球在前12 h 处于快速释放阶段，这可能是由于药物溶解并从聚合物的孔隙中扩散所致。12 h 后的延迟释放阶段可能是由于聚合物的降解。与游离多效唑相比，CS/zein-PBZ 具有明显的缓释特性。对一级动力学方程和Higuchi 动力学方程进行了模拟，得到了相应的拟合系数。很明显，多效唑释放曲线与一级动力学方程相吻合，R2值大于0.99(R12、R22分别代表PBZ和CS/zein-PBZ的释放动力学方程中回归平方和与总离差平方和的比值，比例越接近1，回归拟合效果越好)，表明药物浓度随时间的增加而增加。

图7 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 纳米微球的累积释放曲线和动力学方程

3 结 论

基于壳聚糖与玉米醇溶蛋白静电相互作用包裹多效唑构建了复合纳米微球CS/zein-PBZ NPs 悬浮液，平均粒径为(187±46)nm，具有较好的尺寸分布，以及较高的zeta 正电位(65 mV)。壳聚糖的浓度为0.1%，多效唑为20 mg 时，CS/zein-PBZ 纳米微球的包埋率和载药量达到最高，分别为89.9%和28.8%。在铺展性方面，其静态接触角为60.2°±2.22°，小于多效唑可湿性粉剂的接触角(68.3°±7.33°)，在释放性能研究中，多效唑的释放符合一级动力学方程，且R2值大于0.99。这些都证实了所制备的CS/zein-PBZ纳米微球具有优良的理化性质，铺展性以及缓释性能。