神经嵴来源的外胚间充质细胞在成牙向分化机制方向的研究进展

陈子嫣 赵鹤翔 贾 妮 葛振林

牙齿的缺失常常给人们的口腔健康、功能、美观造成影响，缺失牙如何修复一直是口腔研究领域中备受关注的热点之一。目前，随着生物技术和组织工程学的不断发展，用干细胞构建组织工程化牙齿，从而实现牙体组织再生的技术受到越来越多的青睐和关注。神经嵴细胞作为胚胎发育早期出现的高度迁移性干细胞群，其迁移、分化和牙齿的发生和发育密不可分。牙齿的发育主要与外胚间充质细胞和外胚层表面上皮细胞之间的相互作用有关，这些相互作用主要通过骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、音猬因子同族体超家族（sonic hedgehog， SHH），成纤维生长因子超家族（fibroblast growth factor，FGF），Wnt 信号通路等保守的信号途径介导[1∽4]，并且与神经嵴细胞的迁移分化及定位息息相关。发育生物学显示牙本质、牙髓等牙齿结构主要来源于由胚胎发育期出现的神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）所演化成的外胚间充质组织[5,6]，这其中主要涉及NCCs 的迁移分化、颌骨定位及复杂的分子调控过程。本文主要从神经嵴细胞的迁移分化、颌骨定位等方面系统地回顾了神经嵴细胞在牙齿发生发育过程中的作用，并简要概述了神经嵴细胞在成牙向分化过程中可能的分子通路。

一、神经嵴细胞的迁移分化与牙齿的发生

NCCs在胚胎发育的第三周出现，是胚胎发育过程中短暂出现于神经上皮与上皮前体之间的具有高度迁移性的细胞群，迁移初期NCCs与其他神经上皮细胞失去联系，完成部分或完全的上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT），形成可以在形态上识别的单个或成群的迁移细胞，之后沿着确定的路径迁移并定居于不同的区域，最终分化成为各种各样的衍生物[7]。Zhang 等[8]用LacZ 报告的标记NCCs 基因的转基因方法，证明了NCCs 离开神经褶皱之后通过腹侧迁移参与第一鳃弓的形成。Yuan 等[9]用单细胞RNA 测序分析证明了NCCs进入第一鳃弓后的动态细胞运动，并且通过腹侧的分层迁移实现了NCCs的分化异质性。

牙齿的发生主要依赖于牙源性上皮与外胚间充质的相互作用[6]。通过NCCs 标记示踪法证明了牙髓、牙本质、牙骨质等外胚间充质发育产物均是由NCCs 衍生细胞所产生的[5]，同时在NCCs 所衍生的外胚间充质中表达的同源盒基因的组合作用被认为是决定牙齿形态、大小、位置的因素[10]。

二、神经嵴来源的外胚间充质细胞在牙齿发育过程中的位置确定

在NCCs 迁移形成外胚间充质的过程中通过同源盒基因的组合作用来确定上下颌弓的牙区、无牙区、磨牙区、切牙区的具体位置关系。

1.牙板位置的确定

对控制牙板发育的空间模式和细胞机制现有研究较少。在小鼠牙齿模型中，胚胎发育第9 天，在FGF8 的诱导下Lhx6和Lhx7作为牙齿形成的原始标记仅表达于第一鳃弓口部的外胚层中[11]；胚胎发育第11 天，口腔上皮增厚，牙轴在第一鳃弓上形成。在牙齿发育迹象出现前Pixt2作为牙齿发育的第一个转录标记在上下颌弓近远端和口腔外胚层中出现[12,13]，当Pax9高表达的区域限制性出现成排排列的牙板结构形成未来牙弓后定位于牙齿形成的部位[14]，Pixt2和Pax9均与FGF8 和BMP4 的拮抗作用调节有关，由此推断牙板位置可能是由两种不同类型的信号分子的组合共同决定的。同时在对乳腺的发育研究中表明，未来腺体的正确定位取决于沿背腹轴存在的不同发育阈值的各种分子网络[15]，由此Balic 认为[3]牙板的发育的空间模式也受到类似的分子机制调控，即在发育中的颌骨沿背腹轴形成梯度来确定未来牙列的位置。

2.牙齿类型的确定

关于牙齿类型的确定在早期的研究中有两种理论：发生域理论（在颌骨未来牙弓所在的位置上存在近端磨牙，远端切牙的牙轴，牙齿的类型沿这个牙轴确定）[16]和克隆理论（预编程细胞的单个克隆可以通过诱导牙板启动特定类别的所有牙齿的发育，随着细胞克隆向远端增长的过程中，牙蕾形成，其周围被抑制圈环绕，以限制其他牙齿的发育，直到克隆细胞充分移动为止）[17]。但随着同源盒基因的研究不断进展[10]，可以认为发生域理论和克隆理论应该是相辅相成的，与之相关的有Dlx、Barx、Msx、Alx等基因家族[10,18,19]。其中Dlx基因家族在上、下颌骨的结构区分及磨牙的发育中起到重要的作用。在小鼠实验中，上颌弓Dlx1/Dlx2表达阳性，Dlx5/Dlx6表达阴性，下颌弓Dlx1/Dlx2和Dlx5/Dlx6均表达阳性，当敲除Dlx1/Dlx2时上颌磨牙完全缺失，但下颌磨牙及切牙完好[18]，因此推断Dlx1/Dlx2基因对于上颌磨牙的影响更大，下颌磨牙的完好有可能是Dlx5/Dlx6基因的补偿作用[12]。Barx基因家族与磨牙的形成有关—主要是Barx1，在前磨牙和磨牙的结构域中均有Barx1的表达，同时在雪豹胚胎实验中还发现Barx1的远端极限接近颌弓远端，相对的Barx1阴性区域较小，由此推断Barx1与食肉动物的进化趋势有关[10]。Msx 基因家族对NCCs 的增殖分化及牙齿的正常发育至关重要。当敲除Msx1和Msx2之后磨牙和前牙的发育均会停止[12]，并且Msx1缺失的患者以第二前磨牙的缺失为主要表现[20]。Alx基因家族在NCCs 的早期迁移及切牙发育相关。Alx3在额鼻突中表达明显[19]，且在切牙的结构域显示Alx3阳性[10]。进一步研究还发现这些基因之间的存在与否对于牙齿类型的确定同样重要，并且不同基因之间存在重叠区域，共同决定一定区域中牙齿的结构形态[10]。而在间质中BMP4 调节的Wnt∕β-catenin 信号，对于早期牙齿形态和顺序牙齿的形成至关重要[3]，并且Jarvinen等[21]研究发现间充质中的低Wnt∕β-catenin 信号是继发牙齿萌芽的先决条件。

三、神经嵴来源的外胚间充质细胞在形成相关牙性组织过程中的信号通路

1.FGF信号通路

成纤维生长因子超家族（fibroblast growth factor，FGF）是一种含有保守氨基酸序列的多肽类物质，在哺乳动物胚胎发育过程中大约检测出了23个相关成员，大部分成员均参与了牙齿的发育过程，其中FGF3、FGF4、FGF8、FGF9、FGF10 是牙齿发生的关键信号分子[2,22]。FGF3 和FGF10 主要参与牙胚从蕾状期向帽状期的转变过程，缺失FGF3和FGF10的小鼠模型多表现出牙齿体积减少，牙尖数量减少，颈环结构无法形成等症状；FGF8是诱导牙胚发育的起始因子之一，参与诱导Lhx6、Lhx7、Pax9、Pitx2等基因的表达[22]，敲除FGF8的小鼠第一鳃弓大部分结构缺失，而外源性FGF8 可以诱导退化牙胚体外成牙[23]；FGF4、FGF9 和FGF20 参与釉结的形成，调控牙齿的形态和牙尖的形成[22]。此外也有研究表明在NCCs 向外胚间充质转化的过程中可能存在有来自咽上皮的FGF 信号分子的参与，但具体的分子通路还尚不明确[24]。

2.BMP信号通路

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是少数在上皮和间充质组织之间传递双向信号信号通路之一，在牙齿的的多个阶段都起着重要的的作用。BMP 的传导途径有依赖Smad 的经典通路和不依赖Smad 的非经典通路两种[25]。在小鼠实验研究中，发现BMP2、BMP4 协同FGF8 共同作用诱导Pax9，Pitx2 等基因的表达，参与牙胚在颌骨上的定位；在牙胚发育初期BMP4 调节Msx1、Msx2的表达，激活Tbx2从而诱导BMP4向间充质转移表达，以激活NCCs 衍生间充质的牙源性潜力[3]。在牙胚自蕾状期向帽状期转变的过程中，与BMP4 相似，BMP3 和BMP7 同样表达上调[26]，BMP4、BMP3 和BMP7 的上调表达提示其活跃表达与牙胚的发育相关。有实验显示，在牙齿的早期矿化期间BMP2 的存在与否与成釉细胞的分化及成牙本质细胞的组织分化存在一定的联系，并且BMP2 的缺失会导致成熟牙齿牙釉质和牙本质的量减少[27]。Mu 等[28]发现BMP2 和BMP4 在维持牙根发育过程中上皮-间充质之间的相互作用至关重要，并且这是保证形成牙本质细胞分化和成熟所必须的。

3.Wnt信号通路

Wnt 信号通路在组织、器官的生长发育过程中的作用十分重要，参与细胞的增殖，分化，凋亡等基本活动。在牙齿发育过程中，Wnt主要在参与上皮-间充质之间的信息传导并参与调控牙齿的形态和数量[29]。在哺乳动物牙胚从蕾状期向帽状期发育的过程中，牙源性上皮中的Wnt2，LEF1，TCF7 等Wnt 信号通路的成员的上调表达较其他信号通路多，同时Wnt信号通路的抑制性成员的表达下调[26]，提示Wnt信号通路对于牙胚发育早期有着关键作用；在牙胚从钟状早期向钟状末期的发育过程中，Wnt2 的上调和Wnt9 的下调对于牙齿形态的发生也起着积极的作用，并且Wnt 通路信号部分成员不对称分布造成的微调作用也许与牙齿颊舌侧位置的确定相关[2,26]。在小鼠模型中显示NCCs 衍生的间充质中Wnt∕βcatenin 信号的低表达与牙列的延续性发展紧密相关，强行激活Wnt∕β-catenin 通路会导致第二磨牙及第三磨牙的缺失[21]。在NCCs的体外成牙试验中，成牙组也检测到了Wnt 通路的表达[30]，进一步证实了Wnt信号通路在牙齿发育过程中起到重要的作用。

4.SHH信号通路

SHH 信号是HH 家族中的一种分泌型多肽，SHH 也是通过上皮-间质间的信号转导调节牙齿的形态发生[31]，并在牙齿发育的不同阶段扮演着不同的角色。Dacosta 等[32]在鹌鹑胚胎视线中发现，在NCCs迁移至第一鳃弓过程中，SHH参与协调并促进NCCs 的存活及其多能性的维持。在牙齿发育的开始阶段，可以在增厚的上皮组织中检测到SHH 的高表达[33]。在牙冠形成阶段，抑制SHH 信号的同时成釉细胞的分化也会受到抑制，从而导致正常牙齿形态的破坏[34]。也有研究表明，牙冠的大小取决于表达SHH 的内釉上皮和间充质之间的接触面积大小[35]。在牙根形成阶段，SHH 信号的缺失会造成牙根牙本质的形成失败，进而导致牙根形成缺陷[36]。有研究表明当GAS1 缺乏时可导致SHH 表达上调，导致多生牙的形成[3]，因此，对于SHH 信号在牙齿形成过程中的具体作用仍然还需要进一步探究。

5.其他信号通路

Hippo 通路主要通过负调节Yap 效应器和Taz（转录共激活因子）参与神经嵴细胞的分化和牙齿形态的调节。小鼠模型中显示Yap 和Taz 的过表达会导致牙齿形态的缺陷，而敲除Yap 的小鼠表现出神经嵴细胞的异常分化[37]。同时，在NCCs的体外成牙实验中也检测出Hippo 通路的表达[30]。Smad4 是TGF-β∕BMP 的共同介质，其参与NCCs 向成牙本质细胞的分化、牙本质的形成及TGF-β∕BMP 与Wnt信号之间的相互作用[38]。NCCs 来源的间充质干细胞在体内外的成牙能力较非神经嵴来源的间充质干细胞更好，也有可能是由以Smad4 为核心的TGF-β∕Smad4 信号介导所导致[39]。Runx2 与BMP、Wnt 等信号通路的信号传递有着密切的关系[40]，Yu 等[13]发现BMP信号可通过Runx2依赖途径影响牙齿的正常发育，而Runx2 缺失和重复则可能导致牙齿结构的异常[41]。

四、神经嵴细胞与牙再生研究展望

由于NCCs 的多能分化潜能[42]及其在牙齿发生发育过程中的重要地位[5]，在牙齿再生领域NCCs 也是一个很有趣的细胞模型。有研究利用8 周龄的小鼠建立了FGF8和牙本质非胶原蛋白（DNCP）定向作用的NCCs 体外模型，实现了NCCs 向第一鳃弓外胚层细胞和成牙本质样细胞的分化[43]；也有研究表明将NCCs 与无成牙能力的小鼠牙胚上皮重组后置于小鼠肾包膜下培养可以形成较为完整的牙齿结构[30]；Zhang 等[44]在最近的研究中发现NCCs 与小鼠口腔上皮组织重组后可以在体外分化形成成牙本质细胞，并参与牙胚的形成，同时在裸鼠体内植入经过处理的人牙支架与NCCs 后可以形成组织良好的血管化牙本质-牙髓复合体，这些实验结果表明了NCCs 将可能成为牙组织∕牙齿器官再生应用中有希望的细胞来源。

由于神经嵴在脊椎动物中是暂时的胚胎结构，有报道指出人神经嵴干细胞仍然存在于牙龈、骨髓和牙周组织，目前的技术方法分离出大量用于研究基于干细胞的牙齿发育和再生的初级NCCs 比较困难[44]，但也有研究通过修改用于人胚胎干细胞的方法，将人乳牙牙髓来源的多能干细胞诱导分化为NCCs[45]。

NCCs 是一种胚胎干细胞，可以分化形成牙齿，但与此同时也可以分化形成其他组织结构，诱导其成牙向分化的具体通路还尚不明确，并且在成牙向分化过程中诱导形成成釉细胞、成牙本质细胞等功能细胞的介导因素也未可知。