葛根素温敏分子印迹聚合物的制备及其吸附性能

2023-03-04黄金梅钟海艺杨舒悦黄凤玲

陕西科技大学学报 2023年1期

黄金梅，钟海艺，杨舒悦，黄凤玲

(广西中医药大学药学院，广西南宁 530200)

0 引言

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique，MIT)是将具有一定功能基的功能单体与特定的模板分子结合成单体-模板分子复合物，在交联剂、引发剂的条件下引发聚合反应；再通过物理或者化学法除去模板分子，高分子聚合物主体上就留下了在大小、形状以及功能排列上与模板分子相互匹配的空穴，该空穴对目标分子有专一识别功能[1,2].近年来，由于MIT本身所具有高度分离选择性而被应用于手性药物的拆分、吸附分离、酶催化等方面[3-7].目前，MIT已经成为了世界上的很多国家、学术机构、企事业单位的研究热点[8].

葛根[9]是中药豆科植物野葛Pueraria lobate(Willd.)Ohwi.或者甘葛藤(也称粉葛)Pueraria thomsonii Benth的根.有生津止渴、通络活经、解肌退热、升阳止泻、解酒之功效[10-12].葛根素是中药葛根中的主要成分，为异黄酮类化合物，水溶性弱，能溶于多种有机溶剂中[13].现代药理研究表明，葛根素具有降低血压、抗癌、抗炎等药理作用[14].临床上主要用于治疗心律失常、高血压、心绞痛等疾病，并取得了一定的疗效[15].目前，对于葛根素的提取分离多采用传统技术，例如溶剂提取法、加热回流法、大孔树脂吸附法等，虽能达到一定的提取分离效果，但存在效率低下、溶剂耗费大、有效成分提取不完全等不足.

因此，本文采用分子印迹技术制备以葛根素为模板分子的葛根素温敏分子印迹聚合物，过程中引入温敏单体N-异丙基丙烯酰胺，因其分子链上同时具有一个亲水性的酰胺基和一个亲酯性的异丙基，使葛根素MIPs具有低温溶胀高温收缩的特点，通过改变外界环境温度即可控制模板分子的结合与释放[16-18].本文旨在以葛根素MIPs为材料，探讨其从中药复杂成分中分离富集出目标化合物葛根素的可行性，该研究对MIT在中药领域的发展具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 主要原料

葛根素、槲皮素、木犀草素、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈，阿拉丁试剂(上海)有限公司；硅胶，青岛海洋化工有限公司；甲醇，天津市富宇精细化工有限公司；乙酸，国药集团化学试剂有限公司；溴化钾，天津市大茂化学试剂厂.

1.2 仪器与设备

2X15-3型恒温加热磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SQP型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；BSD-TX318型恒温振荡器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG16-WS型台式高速离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；UV-1780型紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Quanta250型电镜扫描仪，美国FEI公司；Nicolet-iS10型红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司.

1.3 分子印迹聚合物的制备

表1为分子印迹聚合物的合成用料比.以MIP2为例，其制备原理如图1所示，模板分子葛根素与功能单体丙烯酰胺(AM)、温敏单体(NIPAM)溶于50 mL甲醇中，室温下反应30 min，使二者以氢键形式充分结合，之后加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)于70 ℃下充分溶解混合，通氮气除氧15 min后加入AIBN引发剂，继续氮气保护下反应5 h得到聚合物，抽滤烘干后，以体积比为9∶1的甲醇-乙酸溶液为溶剂抽提24 h，再用新鲜的甲醇洗涤三次以除去模板分子和残遗的乙酸，干燥后即得葛根素温敏分子印迹聚合物.非分子印迹聚合物NIP2制备方法类似，过程中不加入葛根素模板分子.

表1 聚合物的合成用料量

图1 葛根素温敏分子印迹聚合物制备原理

1.4 表征与测试

1.4.1 分子印迹聚合物结构表征

采用红外光谱(FTIR)分别对模板分子、NIP、洗脱前后MIP进行表征，溴化钾为背景，检测4 000～400 cm-1波数范围内的红外信号以确认对比相应官能团；利用扫描电镜(SEM)对NIP、洗脱前后MIP表面形貌进行观察，测试前样品进行喷金处理.

1.4.2 分子印迹吸附实验

(1)标准曲线绘制

移液枪准确移取浓度为0.48 mg/mL的葛根素-甲醇标准母液0.30 mL于25 mL容量瓶中，甲醇稀释，摇匀.使用紫外分光光度计，于200～400 nm之间，测量吸光度(A)，取最大吸收波长λmax205.50 nm.移液枪分别量取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL的0.48 mg/mL的葛根素标准溶液于7个25 mL量瓶中，甲醇定容.在所选定的λmax下，测定溶液的吸光度值，以吸光度对浓度进行回归分析，得到葛根素标准曲线回归方程，并绘制标准曲线.同理，绘制槲皮素-无水乙醇溶液和木犀草素-无水乙醇溶液的标准曲线.

(2)等温吸附实验

称取5组MIP和NIP各20 mg于5 mL离心管中，用移液枪分别吸取4 mL浓度为0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的葛根素-甲醇溶液，密封，30 ℃下于恒温振荡器中吸附4 h，取上清液，采用紫外可见分光光度法，测定吸附后的溶液中葛根素的浓度并做好记录，根据吸附前后葛根素浓度的变化，使用公式(1)可以计算分子印迹聚合物的吸附量.

Q=(C0-Ceq)V/M

(1)

式(1)中：Q，分子印迹聚合物对底物的吸附量(mg/g)；C0，吸附前的底物浓度(mg/mL)；Ceq，吸附平衡时的底物浓度(mg/mL)；V，吸附液的总体积(mL)；M，分子印迹聚合物的质量(g).

(3)不同温度吸附

与“等温吸附实验”同法操作，配制适宜浓度的葛根素-甲醇吸附液，调节恒温振荡器中的温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃)，测定吸光度值，用公式(1)计算吸附量.

(4)选择性吸附

分别配制浓度为1.0 mg/mL的葛根素-甲醇溶液、木犀草素-甲醇溶液、槲皮素-甲醇溶液作为吸附液，用紫外可见分光光度计测定吸光度后，根据工作曲线算出吸附后溶液中所含底物的浓度，以此计算出印迹聚合物对各物质的吸附量Q、分配系数kd及对葛根素的选择系数k.

kd=Q/C

(2)

k=kdi/kdj

(3)

式(2)、(3)中：kd，分配系数，mL/g；Q，平衡时MIP对底物分子的吸附容量，mg/g；C，吸附平衡时溶液中底物分子的质量浓度，mg/mL；i、j，目标分离物葛根素及其干扰物，当i=j时，k=1.

1.4.3 分子印迹洗脱实验

根据1.4.2节所述的操作方法，配制浓度为1.0 mg/mL的葛根素-甲醇吸附液，平行称取多份等量(20 mg)的MIP1和MIP2，待吸附4 h达到平衡状态后，离心，取沉淀物进行干燥；对吸附平衡的聚合物进行洗脱，以4 mL的甲醇为洗脱液，分别放入30 ℃、40 ℃、50 ℃恒温振荡器中，振荡1 h后，离心，取上清液；每个样品于每个温度下进行三次平行洗脱实验，通过紫外可见分光光度法测定吸光度，计算洗脱液浓度并最终求得平均洗脱率.

2 结果与讨论

2.1 分子印迹聚合物结构表征

2.1.1 红外光谱分析

如图2所示，葛根素和未洗脱的MIP2的红外光谱图对比知，未洗脱的MIP2在3 172.82 cm-1处出现明显的缔合峰，且峰较宽，伸缩振动区域也出现了葛根素和NIP2的特征峰，以此说明MIP2中的功能单体与模板分子通过氢键的形式结合，且葛根素的吸收峰发生了一定的红移；此外，NIP2和洗脱后的MIP2图谱对比可知，基团的吸收峰位置、形状、强度基本相似，说明MIP2中的模板分子已经被洗脱出去.

图2 聚合物的红外光谱图

2.1.2 扫描电镜(SEM)图像分析

如图3所示，通过扫描电镜对NIP2、洗脱前的MIP2、洗脱后的MIP2的表面形貌进行观察，可以看到所得聚合物材料呈现出不规则的颗粒状，颗粒大小在200～800 nm之间；其中非印迹聚合物NIP2和洗脱前的印迹聚合物MIP2的表面较规整、光滑，洗脱后的MIP2颗粒形状更加不规整，且表面粗糙度增加，空穴细度更小，说明长时间的抽提可将聚合物表面的模板分子洗脱，留下其结构空穴，作为印迹位点.

图3 聚合物的扫描电镜图

2.2 葛根素温敏分子印迹聚合物吸附性能

2.2.1 标准曲线绘制

如图4所示，通过线性拟合得到葛根素-甲醇溶液的标准曲线方程为y=0.087 132 5x-0.033 862 6，R2=0.998 9，说明在选定浓度范围内，葛根素浓度与吸光度呈现良好的线性关系.用相同方法测定木犀草素-乙醇溶液和槲皮素-乙醇溶液的标准曲线方程分别为y=0.123 9x-0.006 9，R2=0.999 7和y=0.130 791x-0.062 551 2，R2=0.999 6，均具有良好的线性关系.

图4 葛根素标准曲线图

2.2.2 等温吸附实验

MIP、NIP的等温吸附曲线结果如图5所示，随着葛根素-甲醇溶液浓度的升高，分子印迹聚合物对葛根素的吸附量也逐渐增大，尤其是在0.4～0.8 mg/mL的浓度范围内，吸附量的增加速率明显，以MIP2为例，在0.4 mg/mL的浓度下，其吸附量为14.47 mg/g，当浓度增大到0.8 mg/mL时，吸附量变为39.19 mg/g，增量达到一倍以上.但是，当葛根素溶液的浓度达到一定值后，随着浓度的继续增大，MIP吸附量的增加速率变小，并逐渐趋于平缓，如MIP2的浓度从1.0 mg/mL增大到1.2 mg/mL时，其吸附量仅从45.51 mg/g增加到46.24 mg/g，这是因为同等质量下，MIP的空穴数量是一定的，在吸附液浓度较低时，葛根素能够迅速地结合到MIP的空穴上，随着浓度的增大，一部分的葛根素首先与聚合物表面上具有一定空间结构的空穴结合，另一部分则需要进入聚合物的内部与深孔结合，在这过程中需要克服一定的传质阻力，最终导致吸附量的增加速率较小，尤其是当浓度增加到1.0 mg/mL时，吸附量慢慢趋向于平衡，说明聚合物对葛根素的吸附接近饱和状态.

图5 不同浓度下NIP与MIP的吸附量

此外，从图5还可以看出，MIP对葛根素的吸附量总是大于NIP，说明MIP上具有与葛根素相吻合的空间结合位点，对葛根素有高度亲和力和特异性识别能力，而NIP上由于没有葛根素的特异性结合位点，故不会对葛根素有特异性吸附，只是简单地与聚合物表面的一些随机产生的空穴发生非特异性结合，所以对葛根素吸附量总是会低于MIP.

为了进一步探究MIP与葛根素的结合特征，我们采用经典的采用经典的Langmuir和Freundlich模型对等温吸附数据进行处理.Langmuir 模型方程表达式为：

(4)

Freundlich 模型方程表达式为:

(5)

式(4)、(5)中：Qm，一定温度下聚合物的饱和吸附量，mg/g；k1，Langmuir 常数，mL/mg；kf、n，经验常数；Ce，葛根素的平衡浓度，mg/mL；Qe，平衡吸附量，mg/g.

拟合数据如表2所示，Langmuir等温吸附模型中，线性关系较为理想，表明葛根素分子印迹聚合物基本以表面单层分子吸附方式为主.葛根素MIP1和MIP2的等温吸附过程与Freundlich等温吸附模型也较为相符，拟合曲线对应的1/n值远小于200，一般认为，1/n反映吸附过程的难易程度，当1/n>200则是难以吸附过程，由此可见，所得分子印迹聚合物对葛根素的吸附非常容易，且随着底物浓度增加平衡吸附容量(Qe)变化较小.

表2 Langmuir和Freundlich等温吸附模型参数

2.2.3 温度对吸附性能的影响

温度对分子印迹聚合物吸附性能的影响如图6所示，在30 ℃条件下，MIPs对葛根素的吸附量最高，随着温度的不断升高，吸附量逐渐下降，其中加了温敏单体NIPAM的MIP2和NIP2变化更为明显，表现出更强的温度响应性.以葛根素温敏分子印迹聚合物MIP2为例，当温度从30 ℃升高到50 ℃时，其吸附量从45.51 mg/g下降到27.30 mg/g，下降率达到40%.这是因为，在不同温度下，温敏单体NIPAM的亲疏水作用不同，温度升高时，NIPAM与溶剂结合的氢键会发生断裂，原印迹空穴中的溶剂被释放，导致空穴收缩，葛根素无法进入空穴，进而使吸附量降低.此外，同一温度下，MIP的吸附量总是大于对应的NIP，进一步表明MIP上存在着与葛根素类似的空间结合位点，能对葛根素产生特异吸附.

图6 不同温度下NIP和MIP的吸附量

2.2.4 选择性吸附性能

为了进一步突出MIP高度分离选择性的特点，本实验选取了葛根素结构相类似的化合物木犀草素和槲皮素作为吸附底物，其结构式如图7所示，在其他条件相同的情况下，对它们进行静态吸附实验，考察MIP对葛根素的专一识别能力.

图7 化合物的结构图

从图8所示的选择性吸附测试结果可知，在30 ℃下，MIP2对葛根素的吸附量为45.51 mg/g，远远大于对木犀草素(20.29 mg/g)和槲皮素(8.10 mg/g)的吸附量，MIP1对三种化合物的选择性也与MIP2相似.表3列出了MIP对不同底物的分配系数及选择性系数，通常情况下，kd越高，表示聚合物对该底物的结合量越大，k越大，表示该聚合物对底物的选择性越好.葛根素的分配系数远高于槲皮素和木犀草素，同时相比于槲皮素和木犀草素，MIP1对葛根素的选择性系数可分别达到4.19和2.63，MIP2的为6.87和2.62，由此说明MIP对葛根素具有良好的吸附能力和选择识别能力.

图8 MIP1和MIP2对葛根素(Puerarin)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)的吸附量

表3 选择性吸附实验结果

2.3 葛根素温敏分子印迹聚合物洗脱性能

如图9所示，吸附饱和的MIP1和MIP2洗脱率均随着温度的升高而增大，但MIP2的增幅明显大于MIP1，50 ℃时，MIP2洗脱1 h后的平均释放量为38.35 mg/g，平均洗脱效率为84.3%，远高于MIP1的53%，这是由于MIP2中具有温敏单体NIPAM，其在温度刺激下与模板分子及溶液之间的氢键作用变化更为明显，在高温时，AM、NIPAM与葛根素之间的氢键更容易发生断裂，导致印迹空穴发生膨胀，进而利于葛根素的释放.