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使用致敏因子OVA构建大鼠分泌性中耳炎模型

2023-03-04刘懿萱张南凤鲁小玲于慧前

现代实用医学 2023年1期
关键词:咽鼓管中耳鼓膜

刘懿萱,张南凤,鲁小玲,于慧前

分泌性中耳炎,又称浆液性中耳炎,以中耳积液和听力下降为主要特征,是耳科的常见病[1-2]。分泌性中耳炎的病因与发病机制复杂,目前普遍认为分泌性中耳炎的发病与细菌和病毒感染、咽鼓管功能障碍、腺样体肥大或炎症、过敏性炎症和咽部返流等相关[3]。分泌性中耳炎病因和发病机制的复杂性也反应了其治疗的多样性,因此需要更进一步的研究,而一个有效的动物模型的建立尤其重要。既往研究发现中耳炎患者的中耳积液中炎症介质富集,包括组胺、肿瘤坏死因子和白介素等,并且炎症介质在动物模型中被证实可诱导分泌性中耳炎的发生[4-6]。本研究探讨致敏因子鸡卵白蛋白(OVA)对大鼠中耳的作用,以及其作为大鼠分泌性中耳炎动物模型诱导因子的有效性,报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40只健康的SPF级Sprague-Dawley(SD)6~8周的雄性大鼠,体质量为250~300 g。所有动物购自维通利华(北京),并在复旦大学上海医学院动物实验中心SPF级动物实验室中进行饲养及相关实验,实验前适应性饲养1周,所有大鼠均排除耳科相关疾病。

1.2 造模方法 将大鼠随机分为对照组和中耳炎组(OME组)。第一阶段为全身致敏阶段,在适应性喂养后第1天,对照组和OME组的大鼠均通过腹腔注射1.2 mg OVA(A5503,Sigma)(将其溶解在0.6 ml的PBS中,用5.14 mg氢氧化铝作为免疫佐剂)。第8天,重复致敏注射。第15和16天是耳内激发阶段,在第15天,用10%水合氯醛溶液(330 mg/kg)麻醉大鼠,使用显微镜下的微型注射器通过鼓膜的后下象限或前下象限将0.1 mg OVA(将其溶解在35l PBS液中)注射到OME组大鼠双侧中耳腔中,对照组大鼠则注射等量PBS。第16天,再次麻醉大鼠,重复鼓膜注射,见图1。

图1 大鼠中耳炎模型建造方案

1.3 检测方法 第16天完成鼓膜注射后即造模完成,进行后续验证。经腹腔注射10%水合氯醛溶液行全身麻醉后,进行下列观察及检测。

1.3.1 镜下观察鼓膜 耳内镜下观察大鼠鼓膜的色泽、形状以及有无积液等。随后,断头处死大鼠,在解剖显微镜下解剖出听泡,观察中耳腔积液情况。

1.3.2 苏木精-伊红(HE)染色切片观察 取出的听泡经打孔后,放置于10%的多聚甲醛中,于4℃固定24 h,然后经过10%乙二胺四乙酸溶液(EDTA),于4℃脱钙24 h,常规石蜡包埋、切片,进行HE染色。通过30×、60×放大倍率的光学显微镜下观察中耳黏膜,评估中耳损伤的严重程度。

2 结果

所有大鼠在试验期间行为、饮食及活动均正常,未见意外死亡。

2.1 鼓膜形态 对照组20只大鼠共40耳,鼓膜呈半透明薄膜状,横径较纵径长,可分为紧张部和松弛部。紧张部鼓膜透明,可见锤骨柄;松弛部鼓膜向外膨隆,可随呼吸向鼓室内外摆动。均未出现内陷、气液平面或者鼓室内气泡等分泌性中耳炎表型。模型组20只大鼠共32耳,鼓膜出现大量的中耳内积液,耳道显示出清晰的径向血管分布,可诊断大鼠存在分泌性中耳炎。

2.2 黏膜组织学改变 对照组20只大鼠共40只耳,中耳黏膜主要是单层扁平上皮,未显示出异常;而模型组20只大鼠共32只耳,可在镜下观察到黏膜和黏膜下组织增厚,见图2。

图2 大鼠中耳黏膜组织

3 讨论

目前,常用于分泌性中耳炎造模的动物包括大鼠、小鼠、豚鼠和兔等,传统的建模方法主要有改变咽鼓管结构和功能[7],包括用木塞、膨胀海绵、烧灼咽鼓管咽口、组织胶等进行咽鼓管的机械堵塞;使用三叉神经紊乱、切断或麻痹腭帆张肌等造成咽鼓管功能障碍;使用细菌及其产物进行鼓室注射造模等[8-10]。近期也有学者使用基因工程技术构建分泌性中耳炎的转基因小鼠模型,包括Sh3pxd2b突变小鼠、22q11.2突变杂合突变小鼠、Oxgr1敲除小鼠等[11-12]。对于实验动物和造模方法的选择,实验室往往会根据实验工作条件,造模方法的难易程度、可行性及稳定性等方面进行考虑,会结合自身研究的切入点选择或改良合适的建模方法。

本研究考虑到大鼠性格温和、外耳道较小鼠宽大,且饲养方便的特点,选择使用大鼠进行造模。OVA作为一种致敏因子,不会破坏中耳腔及咽鼓管的正常解剖结构,且不是细菌及其代谢产物,不会对分泌性中耳炎的炎症反应及进一步的炎症转归的观察产生影响,具有一定的模型优越性。本研究采用微型注射器进行鼓膜穿刺给药,可大大减小对鼓膜局部的创伤,极大降低继发性感染的可能性。通过耳内镜下观察鼓膜形态和鼓室内积液情况,可直接为大鼠分泌性中耳炎的诊断提供依据。HE染色结果显示分泌性中耳炎大鼠的鼓室黏膜增厚,并且有炎性细胞浸润,这进一步说明大鼠分泌性中耳炎模型的成功建立,也从另一方面反映了炎症细胞在分泌性中耳炎发病机制中的作用,这也是未来研究的方向。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 鲁小玲、刘懿萱:实验操作、论文撰写;刘懿萱、张南凤:数据整理、统计学分析;鲁小玲、于慧前:研究指导、论文修改、经费支持

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