不同禽类蛋清蛋白质的婴幼儿体外消化特性差异研究

张 宇,刘安凤,黎海婧,陈 烨,周业飞,宋尚新,2*

(1. 南京晓庄学院 食品科学学院,江苏 南京 211171;2. 南京晓庄学院 儿童食品研究所,江苏 南京 211171;3. 北京工商大学 食品与健康学院,北京 100048)

对于满6月龄的婴幼儿来说,由于单一喂养母乳或配方奶粉已无法满足其营养需要,需要为其添加辅食[1]。其中,蛋白质类辅食的添加量和种类尤为重要。蛋白质是机体细胞和组织的重要组成成分。婴幼儿正处于快速生长发育阶段,其单位体质量的蛋白质需求量高于成人[2]。婴幼儿摄入蛋白质不足易导致低体重、生长发育迟缓、抵抗力下降、贫血等不良后果[3]。此外,由于婴幼儿的胃肠功能较弱,若添加的蛋白质辅食种类不当,极易造成婴幼儿食物过敏、腹泻等不良反应[4]。除了乳类蛋白质之外,肉类和蛋类也属于优质的动物性蛋白质,能够为婴幼儿提供生长发育所需的所有必需氨基酸。我国《7～24月龄婴幼儿喂养指南》建议将肉类和蛋类作为婴幼儿补充蛋白质营养的优选食物种类[5]。

蛋白质的消化率决定了其生物利用率。与成人相比,婴幼儿的胃肠功能发育还很不成熟,尤其对蛋白质的消化能力较弱。研究发现婴幼儿胃液的pH值较高,同时胃中的胃蛋白酶和小肠中的胰蛋白酶的分泌量和活性均较低,导致婴幼儿消化蛋白质的能力远低于成人[6]。不能被完全消化的蛋白质大分子和多肽片段本身会进入后肠经微生物发酵产生的苯酚、硫化物、氨等有害物质,是导致肠绞痛、过敏、胀气、腹泻、便秘等胃肠不适的主要因素[6]。因此,为婴幼儿添加蛋白质类辅食时,需要着重考虑蛋白质的可消化性。

目前已有研究通过体外消化模型比较了婴幼儿对不同乳类蛋白质[7]、肉类蛋白质[8]、豆类等植物蛋白质[2]的消化差异性。Hodgkinson等[7]通过体外方法比较了婴幼儿对牛乳和山羊乳的蛋白质消化差异性,发现两者的消化产物不同。Roux等[2]通过体外方法研究发现,婴幼儿对豌豆和蚕豆蛋白质的消化率与牛乳清蛋白质相似,而对大米和马铃薯蛋白质的消化率则低于牛乳清蛋白质。罗明洋等[8]研究发现,以猪肉、牛肉和鸡肉为原料加工而成的婴幼儿肉泥在理化性质和体外消化特性方面存在较大差异,其中,婴幼儿对猪肉蛋白质的消化率显著高于牛肉和鸡肉蛋白质。然而,目前有关婴幼儿对不同禽蛋类蛋白质的消化性研究还较少。TORCELLO-GOMEZ等(2020年)通过体外方法比较了婴幼儿和成人对鸡蛋卵清蛋白的消化程度,结果发现与成人相比,婴幼儿对鸡蛋卵清蛋白的消化很不完全,仍然有一些完整的卵清蛋白分子和大于9个氨基酸的多肽分子没有消化[9]。

目前在各类禽蛋中,鸡蛋仍然是家庭消费的主要品种。除此之外,其它禽蛋类如鸭蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋等也常出现在人们的日常饮食中,并越来越多地进入婴幼儿的辅食食谱。由于种属不同,不同禽类经过长期进化和人类驯化后,使其禽蛋的蛋白质图谱各具特异性[10]。目前,已有研究者对不同禽蛋的品质特性[10]、物理特性[10]、营养组成[10-12]、蛋白质组学差异[13, 14]进行了对比研究。然而,有关不同禽蛋的蛋白质消化特性的研究还未见报道。为了更好地了解婴幼儿对不同禽蛋蛋清的蛋白质消化差异性,本研究通过体外模拟婴幼儿胃肠消化过程,比较不同禽蛋类(包括鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋和鹌鹑蛋)蛋清的蛋白质体外消化率和消化产物的差异,为人们科学合理安排婴幼儿蛋白质辅食提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:新鲜的鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋均购于当地超市。

试剂:总氨基酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);胃蛋白酶(取自猪胃粘膜,酶活力≥400 units/mg,P7125,Sigma);胰蛋白酶(取自猪胰脏,酶活力1000 units/mg,T7409, Sigma);糜蛋白酶(取自牛胰腺,酶活力40 U/mg,C7762,Sigma);甘氨脱氧胆酸钠(纯度97%,Sigma);牛黄胆酸钠(纯度97%,Sigma)。

仪器:DZF-6050真空干燥箱(上海慧泰仪器制造有限公司);SH220N石墨消解仪(海能电子有限公司);BR4i高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司);K9860全自动凯氏定氮仪(海能电子有限公司); PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);S10手提式高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司);DKZ电热恒温震荡水槽(上海一恒科技有限公司);FA2204N分析天平(常州市幸运电子设备有限公司);IMS-100全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司);UV2400紫外可见分光光度计(舜宇恒平科学仪器有限公司);ZSP-90马尔文粒度分析仪(德芮克国际股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

将完整的禽蛋置于沸水中煮熟,除去蛋壳,取蛋清备测。熟制蛋清的水分含量采用《GB/T 5009.3—2016食品中水分的测定》中的直接干燥法进行测定,其粗蛋白含量采用《GB 5009.5-2016食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定。将熟制蛋清与蒸馏水以1∶1比例混合后,进行匀浆,制成蛋清泥以模拟婴幼儿辅食的状态。

1.2.2 体外模拟婴幼儿胃肠消化蛋白质过程

每种禽蛋设置两组待测样品,每组4个平行。其中一组样品用于模拟胃消化过程,另一组样品用于模拟胃和小肠两步消化过程。每个消化步骤均设置两个空白对照样品。婴幼儿体外消化模型参考LEE等(2019年)[15]的方法并稍作改进。

胃消化过程:配制婴幼儿模拟胃液:取4.39 g NaCl和1.460 g胃蛋白酶溶解后,用0.1 mol/L HCl溶液调节pH值至3.8,定容到500 mL。取6.0 g蛋清泥加入50 mL离心管中,加入10 mL模拟胃液,用0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值至3.8。将离心管插入水浴摇床上,在37 ℃下震荡反应2 h。胃消化反应结束后取出离心管,用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0,以终止胃消化反应。其中一组样品经胃消化后低温冻存备测,另一组样品继续进行小肠消化反应。

小肠消化过程:配制婴幼儿模拟小肠液:取1.46 g NaCl、0.0443 g胰蛋白酶和0.0129 g糜蛋白酶溶解后,用1.0 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5,定容到250 mL。配制婴幼儿模拟胆汁:取0.430 g牛黄胆酸钠和0.3772 g甘氨脱氧胆酸钠溶解,用1.0 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5,定容到200 mL。在完成胃消化反应的离心管中继续加入10 mL模拟小肠液和5 mL模拟胆汁,用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5。将离心管插入水浴摇床中,在37 ℃条件下震荡反应2 h。反应结束后,将离心管置于95 ℃水浴中加热5 min以终止小肠消化反应。

1.2.3 蛋白质体外消化率及消化产物的测定

体外消化率的测定和计算:将消化后的乳浊液在4 ℃条件下6400 r/min离心30 min,取沉淀物进行干燥,采用凯氏定氮法测定干燥沉淀中的蛋白质含量,通过与消化前的蛋白质含量进行比较,参照以下公式计算蛋白质消化率。

(1)

式中:P0为消化前样品的蛋白质含量,g;P1为消化后样品的蛋白质含量,g。

消化产物氨基酸得率的测定和计算:将消化前和消化后的乳浊液在4 ℃条件下6400 r/min离心30 min,取上清液进行定容,采用氨基酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定上清液的氨基酸浓度,并按照以下公式计算氨基酸得率。

(2)

式中:A0为消化前上清液的氨基酸浓度,μmol/mL;V0为消化前上清液的定容体积,mL;A1为消化后上清液的氨基酸浓度,μmol/mL;V1为消化后上清液的定容体积,mL;m为消化前样品的干基质量,g。

1.2.4 可溶性蛋白质粒径的测定

将消化前和消化后的乳浊液在4 ℃下6400 r/min离心30 min后,取上清液直接注入Zeta电位皿,使用马尔文Nano ZS90粒度分析仪在25 ℃下测定上清液中可溶性蛋白质的粒径大小,测量速度为1800 r/min。折射率和吸收参数分别为1.450和0.001。

1.2.5 数据处理

数据分析和统计采用SPSS16.0软件,采用单因素方差分析和Duncan多重比较方法比较各组平均值的差异(P<0.05)。各显著变化指标间的相关性分析采用R语言调用“corrplot”软件包进行分析和作图。

2 结果与分析

图1 煮制后五种禽蛋蛋清的水分和蛋白质含量注:数据表示为平均值±标准差,n=4。各组平均值比较采用单因素方差分析与邓肯多重比较,柱子上方字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。(下同)

2.1 煮制后不同禽蛋蛋清的水分和蛋白质含量

由图1可知,煮制后5种禽蛋蛋清含水量在72%～80%之间。其中,鸽蛋清的含水量最高,为79.5%,显著高于其余4种禽蛋(P<0.05)。鸡蛋清含水量为73.3%,显著高于鹌鹑蛋清(72.8%)、鸭蛋清(72.6%)和鹅蛋清(72.5%)(P<0.05)。鹌鹑蛋清、鸭蛋清和鹅蛋清含水量之间无显著差异(P>0.05)。

煮制后的5种禽蛋蛋清含蛋白质湿基量在10%～15%之间,蛋白质干基含量在44%～56%之间。其中,鸡蛋清含蛋白质湿基量为14.7%、含蛋白质干基量为55.2%,均为5种禽蛋中含量最高。鸽蛋清含蛋白质湿基量为10.8%,为5种禽蛋中含量最低(P<0.05),其含蛋白质干基量为52.8%,与鸡蛋清和鸭蛋清之间差异不显著(P>0.05),但显著高于鹌鹑蛋清和鹅蛋清(P<0.05)。鸭蛋清和鹌鹑蛋清含蛋白质量之间差异不显著(P>0.05)。鹅蛋清含蛋白质干基量为45.0%,为5种禽蛋中最低(P<0.05)。

2.2 婴幼儿体外消化不同禽蛋蛋清的蛋白质消化特性

图2 婴幼儿体外消化不同禽蛋蛋清的蛋白质消化率

2.2.1 蛋白质消化率

由图2可知,经胃消化后,5种禽蛋蛋清的蛋白质消化率为39%～50%。其中,鹌鹑蛋清(49.8%)和鸡蛋清(48.7%)的蛋白质消化率差异不显著(P>0.05),但显著高于其余3种蛋清(P<0.05)。其余3种蛋清的蛋白质消化率从高到低依次为鹅蛋清(45.1%)、鸭蛋清(41.2%)、鸽蛋清(39.2%),且任意两者之间差异显著(P<0.05)。经胃肠两步消化后,5种禽蛋蛋清的蛋白质消化率比单独进行胃消化时有较大提高,达到70%～85%之间。其中,鸡蛋清的蛋白质消化率最高(84.1%),显著高于其余4种蛋清(P<0.05)。其次是鹅蛋清(81.4%)和鹌鹑蛋清(80.2%),两者的差异不显著(P>0.05)。鸭蛋清的蛋白质消化率(76.4%)显著低于鸡蛋清、鹅蛋清和鹌鹑蛋清(P<0.05),但显著高于鸽蛋清(P<0.05)。鸽蛋清经婴幼儿体外胃肠两步消化的蛋白质消化率最低,为70.5%。

图3 婴幼儿体外消化不同禽蛋蛋清的消化产物氨基酸得率

2.2.2 消化产物氨基酸得率

由图3可知,经胃消化后,5种禽蛋蛋清的氨基酸得率由高到低依次为鹌鹑蛋清、鸡蛋清、鹅蛋清、鸽蛋清和鸭蛋清,且任意两组间的差异显著(P<0.05)。经胃和小肠两步消化后,鸡蛋清的氨基酸得率最高,且显著高于其余4种蛋清(P<0.05)。其次是鹅蛋清,其氨基酸得率显著高于鸭蛋清、鹌鹑蛋清和鸽蛋清(P<0.05)。鸭蛋清与鹌鹑蛋清的氨基酸得率差异不显著(P>0.05),鸽蛋清的氨基酸得率最低,且显著低于其余4种蛋清(P<0.05)。

图4 不同禽蛋蛋清消化前、后的可溶性蛋白质粒径大小

2.3 消化前、后的可溶性蛋白质粒径

由图4可知,消化前,5种禽蛋蛋清的可溶性蛋白质粒径由大到小依次为鸽蛋清、鸭蛋清、鸡蛋清、鹌鹑蛋清、鹅蛋清,且任意两组之间的差异显著(P<0.05)。经胃消化后,五种禽蛋蛋清的可溶性蛋白质粒径由大到小依次为鸽蛋清、鸭蛋清、鹅蛋清、鸡蛋清、鹌鹑蛋清,且任意各组之间的差异显著(P<0.05)。经胃肠两步消化后,鸽蛋清的可溶性蛋白质粒径仍然是5种蛋清中最大的,且显著大于其余4种蛋清(P<0.05)。其次是鸭蛋清,其可溶性蛋白质粒径显著大于鹌鹑蛋清(P<0.05)。可溶性蛋白质粒径最小的是鸡蛋清和鹅蛋清,且两者差异不显著(P>0.05)。

2.4 指标间的相关性分析

图5 指标之间的相关性

对蛋白质消化率、氨基酸得率和可溶性蛋白质粒径进行相关性分析(图5)可知,蛋白质的胃消化率与胃肠两步消化率、胃消化后的氨基酸得率和胃肠两步消化后的氨基酸得率之间具有极显著正相关性(Pearson相关系数>0.60,P<0.01)。蛋白质的胃肠两步消化率与胃肠两步消化后的氨基酸得率之间具有极显著的正相关性(Pearson相关系数=0.85,P<0.01),但与胃消化后的氨基酸得率之间无显著相关性(Pearson相关系数=0.42,P>0.05)。胃消化后的氨基酸得率和胃肠两步消化后的氨基酸得率之间无显著相关性(Pearson相关系数=0.19,P>0.05)。此外,消化前、胃消化后和胃肠两步消化后的可溶性蛋白质粒径之间具有极显著的正相关性(Pearson相关系数>0.85,P<0.01)。可溶性蛋白质粒径、蛋白质消化率和氨基酸得率之间具有显著负相关性(图5,黑色圆圈部分),其Pearson相关系数在-0.47至-0.93(P<0.05)。

3 讨论

本研究通过体外方法比较了婴幼儿消化五种禽蛋蛋清的蛋白质消化特性。研究发现,五种禽蛋蛋清经胃消化后的蛋白质消化率为39%～50%,经胃肠两步消化后的蛋白质消化率比单独胃消化时有较大提高,达到70%～85%之间。罗明洋等[8]通过婴幼儿体外消化模型,比较了不同肉类蛋白质的消化率差异,结果发现在胃蛋白酶作用阶段,猪肉泥的蛋白质消化率为28.4%,牛肉泥为19.7%和鸡肉泥为22.9%。经过胃蛋白酶和胰酶两步消化后,猪肉泥的蛋白质消化率为60.73%,牛肉泥为56.82%和鸡肉泥为55.16%。通过对比罗明洋等对肉类蛋白质消化率的研究可知,婴幼儿对禽蛋蛋清的蛋白质消化率总体上高于对肉类蛋白质的消化率。因此,在给较小月龄的婴幼儿添加蛋白质辅食时,建议选择禽蛋类优先于肉类。

分析煮制后的5种禽蛋蛋清的水分含量发现,5种禽蛋蛋清含水量在72%～80%之间。其中,鸽蛋清的水分含量最高,为79.5%,而其余4种禽蛋蛋清的水分含量都接近73%。比较5种禽蛋蛋清的蛋白质含量可知,煮制后的五种禽蛋蛋清含蛋白质湿基量在10%～15%之间,含蛋白质干基量在44%～56%之间。其中,鸡蛋清含蛋白质湿基量(14.7%)和干基量(55.2%)均为5种禽蛋中最高。而鸽蛋清含蛋白质湿基量(10.8%)为5种禽蛋中最低(P<0.05)。鹅蛋清含蛋白质干基量(45.0%)为5种禽蛋中最低(P<0.05)。因此,从单位质量可提供的蛋白质数量上来看,单位质量鸡蛋清可为婴幼儿提供的蛋白质要高于鸭蛋、鹅蛋清和鸽蛋清。

此外,蛋白质消化率也是衡量蛋白质营养价值的重要因素。本研究发现婴幼儿消化5种禽蛋蛋清的蛋白质消化率存在明显差异。其中婴幼儿对鸡蛋清的蛋白质消化率无论在胃消化(48.7%)还是在胃肠两步消化和(84.1%)均是5种禽蛋中最高的,而鸽蛋清的蛋白质消化率无论在胃消化(39.2%)还是在胃肠两步消化后(70.5%)均是5种禽蛋中最低的。经胃肠两步消化后的鹅蛋清(81.4%)、鹌鹑蛋清(80.2%)和鸭蛋清(76.4%)的蛋白质消化率介于鸡蛋清和鸽蛋清之间。蛋白质消化率决定了其为人体提供的可被吸收的氨基酸的量,即生物利用率。本研究通过分析消化产物氨基酸的得率发现,5种禽蛋蛋清经婴幼儿体外胃消化以及胃肠两步消化后的蛋白质消化率与其消化产物氨基酸的得率之间具有极显著的正相关关系(Pearson相关系数>0.80,P<0.01),说明消化率越高的禽蛋蛋清,其为婴幼儿提供的可被吸收的氨基酸的量也越高。其中,经胃肠两步消化后的鸡蛋清的氨基酸得率最高,鸽蛋清的氨基酸得率最低。因此,从蛋白质消化特性角度出发,建议为婴幼儿添加禽蛋蛋清时,应优先选择较易消化的鸡蛋清,其次可选择鹌鹑蛋清,对于不太易于消化的鸽蛋清,则应推迟添加。

蛋清的水分含量与其物理特性密切相关[10]。研究表明,鸽蛋清与其余4种禽蛋蛋清的凝胶特性存在较大差异,鸽蛋清凝胶的透明度较高,同时保水性和硬度也较高,但总切削功(total cutting work)较低,使得鸽蛋清在外力作用下容易变形,但不容易被切断。这种物理特性可能导致在为婴幼儿制作鸽蛋清辅食泥时,因为鸽蛋清不易被破碎而易产生较大的蛋白质颗粒,从而影响婴幼儿的吞咽和消化。基于此假设,本研究比较了消化前和消化后5种禽蛋蛋清的可溶性蛋白质的粒径大小。结果发现,消化前、经胃消化后以及经胃肠两步消化后的鸽蛋清的可溶性蛋白质粒径均为5种蛋清中最大(P<0.05)。经胃肠两步消化后,鸡蛋清的可溶性蛋白质粒径最小(P<0.05)。进一步通过相关性分析发现,5种禽蛋蛋清的可溶性蛋白质粒径在消化前与消化后具有极显著高度正相关,且与蛋白质消化率和消化产物氨基酸得率之间呈显著负相关。这些结果表明,消化前鸽蛋清的可溶性蛋白质粒径较大与其蛋白质消化率较低密切相关。因此,在为婴幼儿制作蛋清泥辅食时,可以通过一定方法降低蛋白质颗粒的尺寸以达到提高消化率的目的。

从分子水平上来看,蛋白质的分子结构[16]、空间构象以及分子内和分子间的交联等结构特征决定了蛋白质的加工特性和生物学功能[17,18],并进而影响蛋白质的消化特性[19]。由于种属不同,经过长期进化和驯养,不同禽蛋蛋清的蛋白质图谱不同。国内外学者运用蛋白质组学方法从鸡蛋清中鉴定到202种蛋白质[20]。其中,含量较高的蛋白质为卵白蛋白占54%、卵转铁蛋白占12%、卵类粘蛋白占11%、卵粘蛋白占3.5%和溶菌酶占3.4%。HU等[13]运用差异蛋白质组学比较了鸡蛋清、鹌鹑蛋清和鸭蛋清的蛋白质组成差异,结果发现三种蛋清中皆存在特异性的蛋白质分子。Sun和Hayakawa研究发现,鸭蛋卵白蛋白中的二硫键的数量多于鸡蛋卵白蛋白,以致鸡蛋清和鸭蛋清的热凝胶透明度和粘弹性有明显差异[21]。有关鸽蛋清的蛋白质组学研究还未见报道。未来有必要对不同禽蛋蛋清经消化后的产物肽段组成和分子结构进行研究,以揭示不同禽蛋蛋清消化特性差异的分子机制。

4 结 论

综上所述,单位质量鸡蛋清可为婴幼儿提供的蛋白质多于鸭蛋清、鹅蛋清、鹌鹑蛋清和鸽蛋清;婴幼儿对鸡蛋清的胃消化率(48.7%)和胃肠两步消化率(84.1%)为5种禽蛋中最高,鸽蛋清的胃消化率(39.2%)和胃肠两步消化率(70.5%)为最低。经胃肠两步消化后的鹅蛋清(81.4%)、鹌鹑蛋清(80.2%)和鸭蛋清(76.4%)的蛋白质消化率介于鸡蛋清和鸽蛋清之间。五种蛋清的蛋白质消化率与其消化产物氨基酸得率呈显著正相关,与消化前、后的可溶性蛋白质粒径呈显著负相关。建议为婴幼儿优先添加鸡蛋清,其次鹌鹑蛋清和鹅蛋清,最后鸭蛋清和鸽蛋清,该研究为给婴幼儿合理添加蛋类辅食提供科学依据。