UPLC-MS/MS测定桂皮中的氨基甲酸酯类农药残留

吴晓萍

福建中检华日食品安全检测有限公司（福州 350028）

桂皮（或肉桂、官桂或香桂）常被用作中药、香料和调料。但近年来，随着食品安全要求的提高和农药的不合理使用，使得各个国家对这类产品制定严格的限量。农药残留问题影响我国桂皮的出口，故有必要建立一种能快速检测桂皮中农药残留的方法。

关于桂皮中农药残留的检测方法主要有气相色谱（GC）[1-3]和气相色谱三重四极杆质谱联用（GC-MS/MS）[4-5]。GC或GC-MS/MS对于检测苯氨基甲酸酯类等沸点高且热稳定性差的化合物并不适用，而液质联用色谱对于这些化合物却有着高于GC或GC-MS/M的选择性和灵敏度[6]。桂皮一种相对基质较复杂中草药，为提高检测的准确性和避免对仪器造成污染，开发一种有效净化前处理很有必要。农药检测常用的提取方法有固相萃取（SPE）[7]、基质固相分散萃取（MSPD）[8]、加速溶剂萃取法（ASE）[9]、液-液萃取（LLE）[10]和凝胶色谱法（GPC）[11]。其中，部分方法（如MSPD）需要大量有机溶剂（LLE）、特殊设备（GPC和ASE）和劳动量，所以环保型的检测技术是目前主推的检测手段[12]，如QuEChERS技术，其操作简便，分析速度快，溶剂使用量少，污染小，近年来被广泛用于复杂基质农药的多残留测定，但在对复杂基质净化效果这方面还存在欠缺。因此，选择一款高选择性的净化剂成为关键突破口，据报道，多壁碳纳米管作为净化剂被应用于农产品中农兽药的检测[13-15]，其吸附性能不仅优于C18、GCB和PSA等常用吸附材料，而且拥有高选择性。故试验采用改良后的前处理方法结合液相色谱串联质谱技术，建立桂皮中氨基甲酸酯类的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS（Agilent 1290-6470，安捷伦有限公司）；低速离心机（德国Sigma公司）；克百威、3-羟基克百威、灭多威、涕灭威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、甲萘威和异丙威（德国Dr. Ehrenstorfer公司）；PSA粉末（美国Supelco公司）；多壁碳纳米管（上海麦克林生化科技有限公司）；多管涡旋混匀仪（逗点生物技术有限公司）；乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和乙酸铵均为分析纯或色谱纯（国药科技）；试验用水为三重过滤去离子水。

1.2 标准溶液的制备

标准储备液：分别准确称取一定质量的8种氨基甲酸酯类农药标准品，用丙酮溶解、定容配制成不同浓度的标准储备液，于-20 ℃的冰箱储存。混合标准溶液：分别吸取不同体积的标准储备液，用乙腈稀释配制成10 mg/L的混合标准溶液，同样置于-18 ℃储存。

1.3 样品的前处理

将样品粉碎，准确称取2.0 g（精确至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL超纯水涡旋30 s后浸泡30 min，加入15 mL乙腈、5.0 g氯化钠混匀和漩涡振荡3 min，在4 000 r/min条件下离心5 min，离心后取2.00 mL上清液于5 mL离心管（50 mg PSA、150 mg无水硫酸镁和5.0 mg选择性多壁碳纳米管），漩涡振荡2 min，在15 000 r/min条件下高速离心5 min，取上层清液过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱条件

色谱条件：ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Agilent公司）；流动相A为0.1%甲酸乙酸铵水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0 min，75% A；1～2.5 min，75%～70% A；2.5～4 min，10% A；4～5 min，10%～75% A，5～7 min，75%A；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 μL。

质谱条件：ESI源，正离子模式，毛细管电压3.0 kV，离子源温度300 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，锥孔反吹气流量50 L/h，脱溶剂气流量900 L/h，多反应监测模式（MRM）。

表1 8种农药的保留时间、监测离子对、碰撞电压（CE）和去簇电压（DP）

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化

氨基甲酸酯类化合物是含有较强的电负性元素，如氧原子和氮原子等，在ESI+模式下，氨基甲酸酯类化合物中的这些强电负性元素可以和喷雾液滴中的H+形成加合离子（[M+H]+），从而实现检测。一般进样瓶和溶剂存在微量的钠离子，这些钠离子会和目标物形成较强的加合离子（[M+Na]+），从而降低基于[M+H]+的检测灵敏度。但如果向流动相的水相中添加适量NH4+，便可有效抑制[M+Na]+的形成从而提高检测[M+H]+的灵敏度[16]。通过MS2Scan选择丰度最高的母离子，对去簇电压进行优化，通过产物离子扫描选择2个响应较大的子离子并对两者的碰撞能量进行优化。响应值大的1组设为定量离子对，响应强度相对较弱的1组设为定性离子对。

为保证各农药成分拥有足够的灵敏度和较好的峰形，同时考察乙腈-水溶液（0.1%甲酸）、乙腈-含4 mmol/L乙酸铵的水溶液（0.1%甲酸）这2种流动相体系，得到如图1所示的总离子流图：选择乙腈-含4 mmol/L乙酸铵的水溶液（0.1%甲酸）为流动相时，仅有部分农药化合物（如涕灭威、灭多威）响应强度被抑制，大部分农药化合物响应度高，峰形较好，故选择加4 mmol/L乙酸铵的-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

图1 8种化合物的总离子流图

2.2 前处理条件优化

2.2.1 样品加水量的考察

从含水量低的样品中提取农药时，用溶剂直接浸提难以充分渗透到组织内部，加入适量的水进行复水处理有利于提高目标农药的回收率。试验比较目标农药分别加入5，10，15和20 mL水量后的回收率，结果表明，加水量5 mL时，6种农药回收率＜70%；加水量10 mL时，8种农药的回收率在70%～110%；加水量＞10 mL时，回收率＞110%的农药数量明显增多，且20 mL加水量的高回收率农药数量较10 mL加水量的多。因此，2 g桂皮中加入10 mL水时，各个农药化合物的提取效果最佳。

2.2.2 提取溶剂的选择

为探究最佳提取方法，同时对乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷4种提取溶剂进行考察，以8种农药在桂皮上的平均回收率为评定依据。在样品提取前加入10.0 mL超纯水涡旋30 s，静置30 min，提高样品的分散程度，增大比表面积。结果表明，二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取剂时，提取液颜色较深，提取出来的杂质较多；丙酮属于易制毒溶剂且不易与水形成分层，对后续操作带来较多不便；乙腈与水可互溶，水可以进入植物组织内部，两者结合可以增加渗透性，从而明显提高提取率。另外，乙腈可以适用极性范围相对广泛的农药，加入氯化钠可使得离子浓度增大且介电常数增大，可具有高离子溶剂的特征，有机物基本上没有离子特征，两者的溶解度进一步增大，可促进两者快速分层，故提取溶剂选用乙腈。

2.2.3 净化剂的选择

传统的QuEChERS吸附剂主要有PSA、GCB、C18和MgSO4，其中PSA是一种含有2个氨基的吸附剂，在不同的环境对不同的物质具有不同的吸附能力，故经常用于可除去样品中的有机酸、脂肪酸和糖类等物质；GCB能去除色素、类胡萝卜素、固醇，但是对具有平面结构目标物也有吸附，故很多文献报道在提取剂中加入甲苯可以提高回收率，但甲苯是易制毒化合物且对人体伤害很大；然而MWCNTs（一种呈管状结构新型的纳米材料）的吸附特性一定程度上优于传统的吸附剂，开展对其吸附性的探究试验，固定PSA 50 mg、MgSO4150 mg用量条件下，考察不同MWCNTs用量（0，2，5，10和15 mg）对目标物回收率的影响，结果表明5 mg用量时目标物回收率最好。综合考虑净化效果与回收率，选择5 mg多壁碳纳米管作为吸附剂。

2.3 方法评价

2.3.1 方法的线性范围、检出限与定量限

在优化的试验条件下，用桂皮空白样品提取液将8种氨基甲酸酯类农药标准溶液混合储备液进行稀释，配制成0.001～0.05 μg/mL的系列基质匹配标准溶液进行检测、绘制标准曲线[横坐标为8种农药化合物的质量浓度（x，μg/mL），纵坐标为定量离子峰面积（y）]，以3倍信噪比计算8种农药化合物在基质中的检出限（SLOD），以最小添加浓度为定量限（SLOQ）。结果显示，在0.001～0.05 μg/mL范围内，8种农药化合物的质量浓度与其峰面积间呈良好的线性关系，相关系数均＞0.99，8种氨基甲酸酯类的检出限为0.003～0.007 mg/kg（详见表2）。

表2 桂皮中8种农药的相关系数、检出限及定量限

2.3.2 基质效应

相比于气相色谱，液质联用色谱的基质效应原因为，基质干扰成分的共流出抑制目标物的离子化效率，其存在常会导致检测结果与实际情况存在误差[17]。通常情况下，基质效应的评价标准是，基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率的比值越接近1，基质效应越小。若比值＜1表现减弱的基质效应，比值＞1表现增强的基质效应。对桂皮的基质效应进行考察，首先对桂皮空白样品进行前处理（按1.3节的方法），配制、测定空白基质匹配标准溶液、纯溶剂标准溶液。结果显示，桂皮的匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率的比值为-6.36～-4.33（＜1），说明其表现出较大的基质抑制效应。因此，试验采用基质匹配标准曲线进行定量分析，以提高分析结果的准确度和精密度。

2.3.3 加标回收率与精密度

往空白的桂皮基质中添加SLOQ，2倍SLOQ和10倍SLOQ这3个水平的混合标准溶液，各加标水平均做6次平行试验，并优化条件后测定，结果如表3所示。8种氨基甲酸酯类回收率范围在71.0%～110.7%，SRSD区间为1.7%～10.3%。如此可见，该方法的准确度、精密度较高，可用于测定样品中多种农药残留。

表3 8种农药的回收率和相对标准偏差

2.4 样品的测定

采用建立的方法测定20批市售桂皮样品中8种农药残留，有3批的克百威及其代谢物3-羟基克百威有检出，检出值在0.02～0.08 mg/kg，其余农药尚未有检出。

3 结论

研究建立了8种氨基甲酸酯类的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）快速筛查方法。乙腈作为提取溶剂，采用改进的QuEChERS净化方法，UPLC-MS/MS测定。该方法在0.001～0.05 μg/mL范围内线性关系良好，R2＞0.99，检出限为0.003～0.007 mg/kg。在SLOQ（0.02 mg/kg），2倍SLOQ（0.04 mg/kg）和10倍SLOQ（0.2 mg/kg）3个添加水平下，8种氨基甲酸酯类在桂皮中的平均回收率均为71.0%～110.7%，SRSD区间为1.7%～10.3%，可应用于实际样品的检测。