L-赖氨酸天门冬氨酸盐质量规格标准制定

潘丙珍，鲍佳生，黄雄俊，卢丽

广州海关技术中心（广州 510623）

L-赖氨酸是组成蛋白质的常见氨基酸之一，是谷物中的第一限制氨基酸，在谷物类食品中强化赖氨酸，是提高其蛋白质营养价值的有效途径。我国在20世纪末开始重视赖氨酸的强化，一般为L-赖氨酸的盐酸盐。L-赖氨酸盐酸盐存在有一定程度不良臭味，且在体内代谢后释放的盐酸可能导致高氯性酸中毒等缺点，限制了其在食品工业中的应用。L-赖氨酸天门冬氨酸盐没有不良气昧，一方面发挥赖氨酸提高谷物食品蛋白质效价的功能，另一方面又增加天门冬氨酸的生理功效[1～5]。日本将L-赖氨酸天门冬氨酸盐作为营养补充剂[6]，GB 14880—2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》规定其可作为营养强化剂L-赖氨酸的化合物来源[7]，GB 29922—2013《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》将其列入可用于特殊医学用途配方食品的氨基酸——赖氨酸的化合物来源[8]。

由于我国尚无L-赖氨酸天门冬氨酸盐的产品质量规格标准，该品种在国内生产和使用受到限制，对进口产品也因缺乏标准而无法监管到位。此次研究主要参考GB 29922—2013和日本食品添加物公定书（第9版），同时参考国际标准及国家标准同类产品质量规格标准，结合国内产品的生产实际和使用情况，初步确定L-赖氨酸天门冬氨酸盐营养强化剂的技术指标和试验方法，标准的制定和颁布实施将为规范食品营养强化剂L-赖氨酸天门冬氨酸盐产品的生产和监管工作提供依据[9～11]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-赖氨酸天门冬氨酸盐样品（宁波盈前科技有限公司、峨眉山市龙腾生物科技有限公司、武汉鑫伟烨化工有限公司、湖北鑫鸣泰化学有限公司、河南宜新生物科技有限公司）。

正丁醇、乙酸、丙酮、甲醇、甲酸、高氯酸、盐酸、硫酸、硝酸、硝酸银（分析纯，广州化学试剂厂）；茚三酮（阿拉丁）；结晶紫（上海远航试剂厂）；L-赖氨酸盐酸盐标准品、L-天门冬氨酸钠一水合物标准品、L-赖氨酸天门冬氨酸盐标准品（阿拉丁）；铅标准溶液（1 000 mg/L，中国计量科学研究院）；砷标准溶液（1 000 mg/L，中国计量科学研究院）。

FP115干燥箱、VD115真空干燥箱（德国BINDER公司）；NICOLET 6700红外光谱分析仪（美国Thermo公司）；AUTOPOL Ⅵ旋光仪（美国RUDOLPH公司）；PHS-3C酸度计（上海虹益）；FO610C马弗炉（日本yamato公司）；900T石墨炉原子吸收光谱仪（美国PE公司）；ELAN-DRC-e电感耦合等离子体质谱仪（美国PE公司）；9130原子荧光光谱仪（北京吉天公司）。

1.2 检测方法

1.2.1 鉴别试验

1.2.1.1L-赖氨酸天门冬氨酸盐鉴别

称取0.1 g（精确至0.001 g）试样，加水溶解并定容至100 mL。取5 mL试样溶液于试管中，加入1 mL茚三酮溶液（1 g/L），沸水浴加热3 min。溶液应呈紫色。

1.2.1.2L-赖氨酸及L-天门冬氨酸鉴别

称取0.1 g（精确至0.001 g）L-赖氨酸盐酸盐标准品及0.1 g（精确至0.000 1 g）L-天门冬氨酸钠一水合物标准品，加水溶解并定容至100 mL，以该混合标准溶液作为对照溶液。称取0.2 g试样，加水溶解并定容至100 mL，作为试样溶液。吸取对照溶液、试样溶液各5 μL，分别点于同一硅胶板GF254上，在层析缸以展开剂（V正丁醇∶V乙酸∶V水=2∶1∶1）展开至少15 cm。取出晾干，在80 ℃干燥箱加热30 min。喷以茚三酮的乙酸-甲醇溶液（1 g茚三酮，加3.0 mL乙酸，用甲醇溶解并稀释至100 mL），在80 ℃干燥箱加热10 min。至斑点出现，立即检视。在自然光下观察硅胶板。在试样溶液与对照溶液相对应的位置应观察到2个主要斑点[12]。

1.2.1.3 红外鉴别

红外光谱分析的测定按GB/T 32199—2015《红外光谱定性分析技术通则》中的执行，以溴化钾压片，用红外光谱分析仪测定，试样谱图与标准品谱图比较，两者应基本一致。

1.2.2L-赖氨酸天门冬氨酸盐含量（以干基计）的测定

称取0.2 g（精确至0.000 1 g）试样于锥形瓶中，加入3 mL甲酸和50 mL乙酸，溶解混匀。加3滴结晶紫-乙酸指示剂（5 g/L），以0.1 mol/L高氯酸标准滴定溶液滴定，溶液颜色由紫色经蓝色变为绿色为终点。同时进行空白试验。

L-赖氨酸天门冬氨酸盐（以干基计）的质量分数w1，按式（1）计算。

式中：V1为试样溶液消耗高氯酸标准滴定溶液体积，mL；V0为空白溶液消耗高氯酸标准滴定溶液体积，mL；c为高氯酸标准滴定溶液浓度，mol/L；9.310为每1 mL的0.1 mol/L高氯酸标准滴定溶液相当于9.310 mg的L-赖氨酸天门冬氨酸盐（C10H21N3O6）；m为试样质量，g；w2为L-赖氨酸天门冬氨酸盐干燥减量的质量分数，%。

1.2.3 比旋光度的测定

称取4 g（精确至0.001 g）经真空干燥后的试样，加入6 mol/L盐酸溶液溶解，调节溶液温度至20 ℃，转移至50 mL容量瓶并用6 mol/L盐酸溶液定容，摇匀。按GB/T 613—2007《化学试剂 比旋光本领（比旋光度）测定通用方法》规定的方法测定，计算L-赖氨酸天门冬氨酸盐的比旋光度。

L-赖氨酸天门冬氨酸盐的比旋光度αm（20 ℃，D），单位以°·dm2/kg表示，按式（2）计算。

式中：α为旋光仪测得旋光度，°；l为旋光管长度，dm；r为每100 mL溶液中L-赖氨酸天门冬氨酸盐的质量浓度（以干基计），g/mL。

1.2.4 pH测定

称取1.0 g（精确至0.001 g）试样，加20 mL水溶解，按GB/T 9724—2007《化学试剂 pH值测定通则》用酸度计测定pH。

1.2.5 干燥减量的测定

称取1～2 g（精确至0.000 1 g）试样，置于已干燥恒重（105±2 ℃，30 min）的称量瓶中。将试样在称量瓶中均匀铺开。在105±2 ℃、真空压力低于2.67 kPa条件下干燥3 h。将称量瓶置于干燥器中冷却至室温，称量，直至恒重。

L-赖氨酸天门冬氨酸盐干燥减量的质量分数w2，按式（3）计算。

式中：m1为称量瓶和试样质量，g；m2为称量瓶和试样干燥后质量，g；m0为称量瓶质量，g。

1.2.6 灼烧残渣的测定

称取1～2 g（精确至0.000 1 g）试样于灼烧至恒重的瓷坩埚中，加几滴硫酸湿润试样，置电炉上缓缓加热，小心碳化至样品完全变黑色，冷却。加1 mL硫酸，加热直至无烟。将坩埚置马弗炉内550±25 ℃灼烧约3 h，使试样完全灰化。待炉温降至200 ℃时，取出放入干燥器内冷却至室温，称重。放入马弗炉内，以550±25 ℃灼烧30 min，如前冷却并称重。如此重复操作，直至连续2次称重之差不超过0.5 mg为止，记下最低质量。

L-赖氨酸天门冬氨酸盐灼烧残渣的质量分数w3，按式（4）计算。

式中：m4为坩埚和试样灼烧后质量，g；m3为坩埚质量，g；m5为坩埚和试样质量，g。

1.2.7 氯化物（以Cl计）的测定

称取0.3 g（精确至0.001 g）试样置于50 mL纳氏比色管中，加硝酸溶液10 mL溶解，加超纯水稀释至50 mL，作为试样溶液。同时准确吸取0.35 mL 0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液置于另一支50 mL纳氏比色管中，加硝酸溶液10 mL，加超纯水稀释至50 mL，作为对照溶液。分别向试样溶液和对照溶液中加入1 mL硝酸银溶液，摇匀，在暗处静置5 min。将两管置于黑色背景，自然光照下，自上向下目测比较两管浑浊度。试样溶液管浑浊度不深于对照管，即试样中氯化物含量≤0.041%。

1.2.8 铅（Pb）的测定

L-赖氨酸天门冬氨酸盐易溶于水，直接用水或者稀硝酸溶解测试后，石墨炉原子吸收光谱法或者电感耦合等离子体质谱法测定铅时，存在基体效应导致加标回收率达不到要求，所以需要进行酸消解去除基体效应。

称取约0.5 g（精确至0.000 1 g）试样，参照GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》中5.2.2微波消解进行前处理，同时做样品空白。配制5，10，20，40和60 μg/L标准工作系列溶液，将样品空白、试样溶液和标准工作溶液按第一法石墨炉原子吸收光谱法进行测试。配制2，5，10，30和100 μg/L标准工作系列溶液，将样品空白、试样溶液和标准工作溶液按第二法电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）测试。结果计算参照相应标准。

1.2.9 总砷（以As计）的测定

L-赖氨酸天门冬氨酸盐易溶于水，直接用水或者稀硝酸溶解测试后，电感耦合等离子体质谱法测定砷时，存在基体效应导致加标回收率达不到要求，所以需进行消解去除基体效应。

称取试样约0.5 g（精确至0.000 1 g），参照GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》第一法电感耦合等离子体质谱法的5.2.1微波消解进行试样前处理，同时做样品空白。配制2，5，10，30和100 μg/L标准工作系列溶液，将样品空白、试样溶液和标准工作溶液按电感耦合等离子体质谱法上机测试。称取约1 g试样于25 mL比色管或50 mL刻度塑料离心管中，用约10 mL去离子水溶解，参照GB 5009.76—2014《食品安全国家标准 食品添加剂砷的测定》第二法氢化物原子荧光光度法12.1.1湿法消解，加入硫脲溶液（50 g/L）2.5 mL，用去离子水定容至25 mL刻度并混匀，备测，同时做样品空白。配制2，5，10，40和60 μg/L标准工作系列溶液，因试样前处理方法为用水直接溶解，标准系列溶液制备不加硫酸。将样品空白、试样溶液和标准工作溶液按氢化物原子荧光光度法上机测试。结果计算参照相应标准。

2 结果与分析

2.1 国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐的技术指标对比

对现行国内外有关法律、法规和标准情况进行查阅，GB 29922—2013规定可用于特殊医学用途配方食品的L-赖氨酸天冬氨酸盐质量规格，日本公定书（第9版）制定关于L-赖氨酸天门冬氨酸盐的产品标准。研究制定标准草案主要参考GB 29922—2013和日本公定书，其中L-赖氨酸天门冬氨酸盐含量（以干基计）、比旋光度（以干基计）、pH、干燥减量、灼烧残渣、铅和砷这几个项目和指标参考GB 29922—2013。在此基础上，参考日本公定书，增加鉴别氯化物（以Cl计）。对于干燥减量、灼烧残渣、铅和砷这4个项目，GB 29922—2013的规定比日本公定书要求更为严格。标准应与特医食品相关标准指标衔接，因此，干燥减量、灼烧残渣、铅和砷指标参考GB 29922—2013。研究制定标准与国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐的技术指标对比如表1所示。

表1 国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐标准的技术指标对照表

2.2 国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐标准试验方法对比

对于各项技术指标的试验方法，研究制定标准草案中比旋光度（以干基计）、pH、氯化物（以Cl计）、铅（Pb）和总砷（以As计）等效采用国家标准的方法。L-赖氨酸天门冬氨酸盐含量（以干基计）、干燥减量、灼烧残渣采用日本公定书（第9版）的方法。鉴别方法中第1个方法采用日本公定书方法——茚三酮显色法，第2个方法由日本公定书（第9版）纸色谱法改成参考中国药典（2020版）氨基酸鉴别的通用方法-薄层色谱法。因为在方法验证过程中，发现纸色谱法不能有效地分离L-赖氨酸与L-天门冬氨酸，而薄层色谱法能很好地达到分离效果，并且操作更快捷方便。鉴别试验在日本公定书的基础上增加红外光谱法，红外光谱法是有机物鉴别有效手段之一，使用广泛，因此增加该方法。国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐标准试验方法对比见表2。

表2 国内外L-赖氨酸天门冬氨酸盐试验方法对照表

2.3 试验方法验证及产品检测结果

L-赖氨酸天门冬氨酸盐生产工艺主要有2种：第1种是以游离L-赖氨酸和L-天门冬氨酸为原料，经过中和、浓缩、结晶制得；第2种是L-赖氨酸盐酸盐离子交换后与L-天门冬氨酸经中和、浓缩、结晶而制得。标准起草过程中共收集到5个厂家、2种不同工艺生产的L-赖氨酸天门冬氨酸盐10批次产品验证试验方法及进行产品各指标检测。结果显示，各试验方法均能满足标准要求，合适可行，产品各项指标均符合标准要求（见表3）。

表3 L-赖氨酸天门冬氨酸盐产品检测结果汇总表

3 讨论

L-赖氨酸天门冬氨酸盐作为食品营养强化剂L-赖氨酸的化合物来源，用于大米、小麦粉、杂粮粉及其制品和面包中时，技术指标参考日本公定书（第9版）是合适的。但同时L-赖氨酸天门冬氨酸盐作为可用于特殊医学用途配方食品的氨基酸——赖氨酸的化合物来源，可根据所使用人群的特殊营养需求添加使用，质量规格必须满足《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》（GB 29922—2013）中的要求，因此对于干燥减量、灼烧残渣、铅（Pb）和总砷（以As计）这4个指标，研究制定标准应参考要求更为严格的GB 29922—2013的规定。在标准研制过程中，对相关生产企业进行调研，以及对不同厂家产品进行干燥减量、灼烧残渣、铅（Pb）和总砷（以As计）这些项目的检测，结果表明产品均能满足标准草案各项指标的要求，标准草案指标设置科学合理。

各项技术指标的试验方法为体现标准的实用性、统一性原则，尽量与相关检验方法标准、生产卫生规范相配套、相协调，研究制定标准草案中比旋光度（以干基计）、pH、氯化物（以Cl计）、铅（Pb）和总砷（以As计）等效采用国标的方法。日本公定书（第9版）中规定总砷（以As计）≤3.0 mg/kg，检测方法为限量法。研究制定标准草案规定总砷（以As计）≤0.2 mg/kg，检测方法如选择限量法显然不合适，选择等效采用国标通用方法GB 5009.11—2014或GB 5009.76—2014，经实际样品加标回收验证，方法合适。

4 结论

通过对国内外相关的技术法规标准及L-赖氨酸天门冬氨酸盐生产和使用单位进行深入调研，详细了解其生产工艺，在参考国内外相关技术、法规、标准的基础上，同时考虑到国内产品实际情况及我国相关检测技术，参照相关的国际标准和国际食品安全风险评估结果，充分考虑我国社会经济发展水平和客观实际的需要，科学制定标准的技术指标及检测方法。并将收集到的产品对设置的全部指标进行方法验证及产品质量检测。遵循公开、公平、公正原则，对标准初稿向社会各界多方面征求意见。标准起草工作科学、合理、公开、透明。食品营养强化剂L-赖氨酸天门冬氨酸盐产品标准的研制和颁布实施，将填补相关标准空白。