MicroRNA-129-5p、SOX4在宫颈癌组织中的表达及其与患者临床病理特征、预后的关系*

杨萌，袁超燕，熊焱强

（1.华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院 妇产科，湖北 武汉 430014；2.湖北民族大学附属民大医院 妇科，湖北 恩施 445000）

宫颈癌是危害全球女性健康的最常见的癌症类型之一，发病率和病死率次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌[1]。根据国际癌症研究机构的数据，2018年，宫颈癌患者人数为57 万，比过去10年增加了7.8%，死于该疾病的人数达31.1 万[2]。因此，尽管推荐了宫颈癌筛查方案，但近年来世界范围内宫颈癌的发病率和病死率都逐步增长[3]。有研究发现，性别决定区Y 框蛋白4（sex-determining region Ybox 4,SOX4）可作为microRNA-129-5p（miR-129-5p）的直接靶点，两者均参与宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型[4]。然而，目前关于miR-129-5p、SOX4 与宫颈癌患者预后的关系尚不清楚。因此本研究通过检测宫颈癌组织与癌旁组织的miR-129-5p、SOX4 表达，探讨两者与宫颈癌进展及预后的关系，以期为宫颈癌治疗提供一定理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月—2019年8月湖北民族大学附属民大医院的101 例宫颈癌组织、癌旁组织标本及其临床资料。其中，年龄< 50 岁39 例，年龄≥ 50 岁62 例；产次≤ 1 次51 例，> 1 次50 例；FIGO 分期Ⅰ期47 例，FIGO 分期Ⅱ期54 例；鳞癌64 例，腺癌37 例；中/高分化48 例，低分化53 例；无淋巴结转移46 例，有淋巴结转移55 例。纳入标准：①宫颈癌均通过活检或术后病理检测确诊，均为首次诊治；②标本保存完整，随访资料齐全。排除标准：①合并血栓性疾病、血液系统疾病或系统性红斑狼疮等自身免疫疾病者；②有严重肝肾功能不全或其他不适合手术疾病者；③其他原发性恶性肿瘤疾病者。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-129-5p mRNA 相对表达量手术获取癌旁组织（与癌组织距离> 5 cm）和宫颈癌组织，液氮冷冻后置于-80℃超低温冰箱保存。组织研磨后采用TRIzol 试剂（上海高创化学科技有限公司，货号：15596026）提取总RNA，RNA 检测合格后逆转录（上海谷研实业有限公司，货号：GOY-C6397）cDNA，使用ABI 7500 型qRT-PCR 仪（美国ABI 公司）进行qRT-PCR 扩增。反应条件：95℃预变性90 s；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环。各样品均重复3 次，U6为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算miR-129-5p mRNA 相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 免疫组织化学检测SOX4 蛋白阳性表达手术获取癌旁组织（与癌组织距离>5 cm）和宫颈癌组织，10%甲醛浸泡固定，制成4 μm 石蜡切片，严格按照免疫组织化学试剂盒（上海经科化学科技有限公司，货号：RP1105）说明书进行染色，待完成染色后封片镜检，出现棕褐色或棕黄色颗粒则为SOX4 蛋白阳性表达。采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。①阳性着色细胞数：每张切片上观察5 个高倍视野（×400），计数阳性细胞百分比。阳性细胞数> 75%为4 分、> 50%～75%为3 分、>25%～50%为2 分、5%～25%为1 分、< 5%为0 分。②染色强度：无色为0 分、浅黄为1 分、棕黄为2 分、棕褐为3 分。两种分数相乘，乘积为0～3 分为阴性表达，乘积>4 分为阳性表达。

1.3 随访

手术结束后随访3年，方式为定期门诊复查或电话，必要时进行影像检查。随访期间患者出现癌因死亡则随访结束，随访截止时间为2022年8月。根据3年随访期间患者癌因死亡情况将其分为生存组79 例和死亡组22 例，所有患者均未失访。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用配对t检验；绘制Kaplan-Meier 曲线分析miR-129-5p、SOX4 表达与宫颈癌患者3年生存率的关系；采用多因素Cox回归分析宫颈癌患者预后的影响因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌旁组织和宫颈癌组织中miR-129-5p mRNA相对表达量、SOX4蛋白阳性表达率比较

癌旁组织和宫颈癌组织中miR-129-5p mRNA相对表达量、SOX4 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05），宫颈癌组织miR-129-5p mRNA 相对表达量低于癌旁组织，SOX4 蛋白阳性表达率高于癌旁组织。见表2 和图1。

表2 癌旁组织和宫颈癌组织中miR-129-5p mRNA相对表达量、SOX4蛋白阳性表达比较 （n =101）

图1 癌旁组织和宫颈癌组织中SOX4蛋白表达（免疫组织化学×200）

2.2 宫颈癌组织中miR-129-5p mRNA 相对表达量、SOX4蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系

以宫颈癌组织中miR-129-5p mRNA 相对表达量的中位数为界，101 例患者中51 例miR-129-5p低表达，50 例miR-129-5p 高表达；SOX4 蛋白阳性表达68 例，阴性表达33 例。结果显示，不同年龄、产次、病理类型患者宫颈癌组织中miR-129-5p、SOX4 表达差异无统计学意义（P>0.05）。FIGO 分期Ⅱ期、低分化、有淋巴结转移的患者宫颈癌组织中miR-129-5p 低表达，SOX4 蛋白阳性表达率高于FIGO 分期Ⅰ期、中/高分化、无淋巴结转移患者（P<0.05）。见表3。

表3 不同临床病理特征患者宫颈癌组织中miR-129-5p高/低表达及SOX4蛋白阳性/阴性表达的比较 例（%）

2.3 miR-129-5p、SOX4 表达与宫颈癌患者3年生存率的关系

Kaplan-Meier 生存曲线结果显示，miR-129-5p低表达患者的3年生存率64.71%（33/51）低于miR-129-5p 高表达患者3年生存率92.00%（46/50）（χ2=11.040，P=0.001）；SOX4 阳性表达患者的3年生存率70.59%（48/68）低于SOX4阴性表达患者3年生存率93.94%（31/33）（χ2=7.111，P=0.008）。见图2、3。

图2 miR-129-5p高/低表达宫颈癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 宫颈癌患者3年生存率的单因素分析

生存组和死亡组的年龄、产次、病理类型、分化程度、淋巴结转移比较，差异无统计学意义（P>0.05）；两组的FIGO 分期比较，差异有统计学意义（P<0.05），死亡组FIGO 分期Ⅱ期患者比例低于生存组。见表4。

表4 宫颈癌患者3年生存率的单因素分析 例（%）

2.5 宫颈癌患者预后影响因素的多因素Cox 回归分析

图3 SOX4蛋白阳性/阴性表达宫颈癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

以宫颈癌患者3年内是否死亡（否 = 0，是 = 1）为因变量，以miR-129-5p（低表达 = 0，高表达 = 1）、SOX4（阴性表达 = 0，阳性表达 = 1）、FIGO 分期（Ⅰ期 = 0，Ⅱ期 = 1）为自变量，进行多因素Cox 回归分析，结果显示，SOX4 阳性表达[H^R =2.793（95% CI：1.495，5.219）]是宫颈癌患者3年内死亡的危险因素（P<0.05），miR-129-5p 高表达[H^R =0.809（95% CI：0.700，0.935）]是宫颈癌患者3年内死亡的保护因素（P<0.05）。见表5。

表5 宫颈癌患者预后的多因素COX回归分析

3 讨论

宫颈癌是影响全球女性健康的第四大恶性肿瘤，被认为是女性死亡的第二大原因[5-6]。宫颈癌的治疗采用了多种策略，包括放疗、化疗和手术[7]。然而，宫颈癌细胞在晚期表现出的攻击性行为，需要新的策略来消除[8]。寻找可靠的遗传、分子和免疫组织化学标志物，以早期预测肿瘤进程和预后，也是目前现代肿瘤学的一项重要任务。

研究显示[9-10]，多种miRNAs 在宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移等过程中发挥重要作用。miR-129-5p属于miR-129 家族，在人体的众多组织和器官中表达，并广泛调节生物学功能，其异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展有关[11-12]。本研究结果显示，宫颈癌组织miR-129-5p 表达低于癌旁组织。提示miR-129-5p 可能作为一种癌症抑制性miRNA 参与宫颈癌的发生、发展。相关研究同样发现抑制miR-129-5p 可加速宫颈癌细胞的侵袭、迁移等进展[13]，与本研究结果基本一致。目前miR-129-5p表达下降的分子机制尚不明确，可能与其下游因子转录后调控及其编码基因突变等有关。有研究显示，miR-129-5p 表达升高从而下调宫颈癌中Hedgehog 信号通路抑制ZIC2，从而抑制细胞侵袭、迁移及肿瘤血管生成[14]。进一步表明miR-129-5p可能通过调控下游多个相关通路，参与宫颈癌进展。

SOX 蛋白是能够调节不同分子途径的转录因子，其表达在胚胎发生、疾病发展和致癌过程中变化[15]。SOX4 是SOX 基因家族的成员，在脊椎动物中高度保守，与骨、胰岛和心脏的发育有关，且在20 多种恶性肿瘤中高度表达，并促进恶性表型[16]。ZHANG 等[17]研究显示，在宫颈癌组织和细胞系中，SOX4 表达上调，长链非编码RNA SNHG5通过负调控miR-132 增强SOX4 表达来促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究发现宫颈癌组织中SOX4 蛋白高表达，与CHEN 等[18]研究一致。推测SOX4作为miR-129-5p的靶基因，受miR-129-5p的负向调控，参与宫颈癌细胞的增殖、迁移。

本研究结果进一步显示，FIGO 分期越高、分化程度越低、发生淋巴结转移患者的miR-129-5p表达越低、SOX4 表达越高。提示miR-129-5p、SOX4 可反映宫颈癌病情严重程度，miR-129-5p 表达降低后与SOX4 的3'-非编码区结合减少，导致SOX4 表达增加，促进宫颈癌细胞的侵袭、迁移及肿瘤血管生成，两者有可能成为新的肿瘤相关标志物。此外，miR-129-5p 低表达、SOX4 阳性表达患者3年生存率明显较低，两者均是宫颈癌患者预后的影响因素，提示miR-129-5p、SOX4 表达异常可能与宫颈癌患者预后不良有关，有成为预后生物标志物的潜力，但需进一步研究验证。

综上所述，与癌旁组织相比，宫颈癌组织中miR-129-5p 表达降低、SOX4 表达升高，两者表达均与FIGO 分期、分化程度、淋巴结转移及3年生存率有关，有可能成为宫颈癌预后的生物标志物。但由于本研究方法较为基础，研究样本量相对较小，随访时间较短，尚需大样本及基础研究验证两者参与宫颈癌发生发展的机制。