MUC5AC、TIMP-1在毛细支气管炎患儿血清中表达及与喘息发作的相关性探究

郑硕，闫文豪

毛细支气管炎是急性下呼吸道感染性疾病且在临床较为常见，小儿群体是此病的易感群体，多发于冬季，其病变部位主要在肺部的细小支气管，临床常见症状多表现为呼吸急促、呼气性喘鸣，其中少数患者存在喘息反复性发作的现象，若未得到积极治疗甚至恶化转变为哮喘、呼吸衰竭，危及患儿生命安全[1]。近年来，多项研究结果表明[2]，毛细支气管炎的发病速度较快，故早期诊断此病有助于患儿尽早接受积极治疗、改善预后。黏蛋白5AC(MUC5AC)具有评估气道上皮黏液分泌的功能，是黏蛋白家族主要成员之一；基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)是基质金属蛋白酶的内源性天然抑制因子，对基质金属蛋白酶的活性具有很好的抑制作用，其中属基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)活性最强且参与气道炎症损伤和气道重塑的链接转换[3-5]。本研究旨在检测该疾病患者血清中MUC5AC、TIMP-1表达，对比两者在毛细支气管炎患儿血清中表达变化、在发病机制中的作用及与喘息次数的相关性，以期为临床小儿毛细支气管炎的治疗提供科学依据，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性选取2020年2月至2021年3月在方城县妇幼保健院内儿科就诊的毛细支气管炎患儿78例作为研究组研究对象，研究组按病情严重程度被分为轻症45例，重症33例；男37例，女41例；年龄3个月～2岁，出生时母亲年龄23～36岁，呼吸疾病史：有45例，无33例；病程3～12 d；另外同期选取78例在方城县妇幼保健院内儿科进行健康体检的健康儿童作为对照组研究对象，年龄4个月～2岁，出生时母亲年龄25～34岁，两组基线资料对比(P＞0.05)，见表1.上述研究对象家属对本次研究均知情、签署同意书，方城县妇幼保健院伦理委员会已批准，批准号：(2020)伦审第(26)号。

表1 两组基线资料比较[n，(±s)]

女43 41平均年龄/岁 1.29±0.14 1.25±0.16 0.099 1.662出生时母亲平均年龄/岁27.52±2.69 27.56±2.62 0.094 0.925农村 21 24剖宫产 14 17性别男35 37 0.103 0.748居住环境城镇 57 54 0.281 0.596分娩方式自然分娩 64 61 0.362 0.547项目 对照组 研究组 统计值 P值

1.2 选取标准 纳入标准：符合《诸福棠实用儿科学》[6]中毛细支气管炎诊断标准且经临床查体、影像学检查确诊；存在显著的喘憋和咳嗽症状；家属均知情且签署承诺书。排除标准：肝肾功能异常、存在自身免疫性疾病；入院前1个月接受过免疫抑制剂、抗血小板等药物治疗，影响研究结果；肺部发育不良引起咳嗽；先天气道性疾病导致高反应咳喘；合并哮喘等其他呼吸系统疾病。

1.3 指标检测

1.3.1 标本采集 入组后采集清晨空腹静脉血5 mL，室温环境静置2 h，3 000 r/min、r＝15 cm离心15 min，-80℃冰箱，保存待用。

1.3.2 MUC5AC检测 采用逆转录- 聚合酶链反应(RT-PCR)法检测两组研究对象血清MUC5AC表达，实验步骤：将RNA 反转录为cDNA，条件：25 ℃、50 ℃、85 ℃(10 min、45 min、5 min)。cDNA 进 行 扩 增，引 物 序 列：MUC5AC，F：5’-CGGGTACCTGAG GGACGC CTTGGCTC-3’，R：5’-CCG CTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3’；以U6 为 内 参，F：5’-GGTTAGAAGTCATACG-3’，R：5’-TGTCATGAATGATCC-3’。反应体系为：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2×)，2 μL cDNA模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。产物扩增条件：预变性95 ℃、变性均5 min，退火95 ℃、延伸72 ℃分别15 s、30 s，共40个循环，MUC5AC相对表达量采用2-ΔΔCt计算。

1.3.3 TIMP-l 检测 采用酶联免疫吸附法(ELIEA)检测血清TIMP-1水平，实验步骤：将冰箱中血清标本取出放置室温30 s，备置标准血清及溶液，300 μL洗板液洗板对其进行30 s冲洗，微孔拍干后依次加入检测缓冲液、标准液、样本、检测抗体均50 μL，封板，震荡，室温(37 ℃)孵育2 h，洗板，100 μL的酶标记物导入检测孔，封板，震荡，放置室温内45 min，洗板，将100 μL底物液加入微孔，30 min避光孵育、加入100 μL终止液、震荡，使用酶标仪在450 nm处测吸光值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0处理数据。用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合则计量资料使用均数±标准差(±s)进行描述，组间两两比较采用独立t检验，多组间行F值数据计算，计数资料以率[n(%)]表示，Pearson相关性分析MUC5AC、TIMP-1与毛细支气管炎的相关性，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MUC5AC、TIMP-1在对照组、研究组血清中比较 相比对照组，研究组血清中MUC5AC、TIMP-1较高，以研究组重症最为显著表现为MUC5AC(3.85±0.43)、TIMP-1(179.23±18.54)ng/mL，差异具有统计学意义(F＝93.240、24.135，P均＜0.05)。见表2。

表2 MUC5AC、TIMP-1在对照组、研究组血清中比较(±s)

表2 MUC5AC、TIMP-1在对照组、研究组血清中比较(±s)

注：MUC5AC＝黏蛋白5AC，TIMP-1＝基质金属蛋白酶抑制因子-1；下同。

组别 例数 MUC5AC TIMP-1/(ng·mL-1)对照组 78 0.72±0.08 128.46±13.57重症 33 3.85±0.43 179.23±18.54 F值 93.240 24.135 P值 0.001 0.001研究组轻症78 45 2.16±0.24 146.82±15.03

2.2 研究组MUC5AC、TIMP-1与喘息发作的相关性 研究组MUC5AC、TIMP-1与喘息发作呈正相关，即喘息次数越多，MUC5AC(4.23±0.46)、TIMP-1(182.46±18.27)ng/mL越高，差异具有统计学意义(t＝16.570、7.510，P均＜0.05)，见表3。

表3 研究组MUC5AC、TIMP-1与喘息发作的相关性(±s)

表3 研究组MUC5AC、TIMP-1与喘息发作的相关性(±s)

项目 例数 MUC5AC TIMP-l/(ng·mL-1)喘息＜3次 45≥3次 33 2.87±0.26 153.79±15.38喘息4.23±0.46 182.46±18.27 t值 16.570 7.510 P值 0.001 0.001

2.3 MUC5AC、TIMP-1 之间的相关性分析 以MUC5AC、TIMP-1 进行相关性分析，结果显示，MUC5AC、TIMP-1 正 相 关(r＝0.468、P＝0.001)，见图1。

图1 MUC5AC、TIMP-1之间相关性分析

2.4 毛细支气管炎发生影响因素的多元Logistic回归分析 毛细支气管炎为因变量(未发生＝0，发生＝1)，MUC5AC、TIMP-1为自变量，赋值升高设为1，正常设为0，纳入二分类多因素Logistic回归模型分析，结果显示，MUC5AC、TIMP-1为影响毛细支气管炎发生的危险因素，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 毛细支气管炎发生影响因素的多元Logistic回归分析

3 讨论

研究表明[7-8]，小儿支气管炎的发生发展与炎症因子和黏液分泌增加密切相关，患儿多出现一系列呼吸症状，如鼻炎、呼吸急促、呼吸做功增加等，且与患儿后期是否发生复发性喘息和哮喘等存在一定关联。毛细支气管炎目前临床认为此病是多种因素共同作用的结果，其中过敏体质、家族哮喘史、长期吸入二手烟等均是此病的诱发因素，目前临床上暂无早期诊断后发生反复喘息的标志性指标[9]。

黏蛋白具有湿润吸入气体、预防支气管及肺泡上皮干燥的功效，对呼吸道具有较好的保护作用，可防止和避免有毒气体或微生物的入侵[10-11]。呼吸道黏液的重要组成部分为黏蛋白，而MUC5AC是一种气道黏液中重要的黏蛋白，且经临床研究证实[12-14]，其水平变化在慢性鼻- 鼻窦炎、呼吸机相关性肺炎等多种肺部疾病的发生发展中起着重要作用，且备受广大医者的关注。本文研究数据得出，MUC5AC在毛细支气管炎患儿血清中呈异常高表达且其表达随喘息次数增加而升高，MUC5AC的作用机制包括MUC5AC表达抑制剂叉头转录因子A2(FoxA2)、白细胞介素-13(IL-13)诱发黏液化生和MUC5AC表达、表皮生长因子受体诱导MUC5AC表达，在支气管炎发病过程中，炎症联级反应上调信号转导与转录活化因子6磷酸化并抑制FoxA2 表达，在一定程度上可促进MUC5AC表达，诱导黏液高分泌，由此佐证在小儿毛细支气管炎发生及病情发展中MUC5AC起着重要的调节作用；此外，毛细支气管对哮喘的发病具有很大的影响，MUC5AC高表达意味着气道黏液高分泌，其水平升高伴随着喘息次数增加，可预测喘息发作，亦可为哮喘早期防止提供依据。

上皮下纤维化、细胞外基质(ECM)沉积、基底膜增厚等均为临床气道重塑的常见病理特征，可造成持续性的气道高反应和不可逆的气流阻塞，在呼吸道重构过程中TIMP-1是一个重要因子，若其表达水平异常升高则提示可能出现哮喘气道重塑的标志[15-16]。TIMP-1对成纤维细胞增生和胶原的合成以及上皮细胞增殖或纤维化具有促进作用，还具有细胞生长因子的作用，在气道重塑的发生和发展中发挥着关键作用[17]。TIMP-1和金属基质蛋白-9(MMP-9)在机体健康的状态下水平处于相对平衡状态，但在支气管疾病发生发展过程中，因TIMP-1对MMP-9具有生理抑制性，在支气管疾病发生时，TIMP-1水平随MMP-9水平的升高而升高，进而加重ECM在气道内沉积，最终导致气道重塑[18]。本文数据分析得出，TIMP-1在毛细支气管炎患儿血清中表达异常升高且喘息次数越多、TIMP-1表达越高，其作用机制可能为高表达TIMP-1促进MMP-9的活性增加，进而破坏气道和肺部的细胞外基质及基底膜在气道和肺重建中起左右，破坏呼吸系统细胞外基质和基底膜，TIMP-1与喘息密切相关，是喘息气道重塑的重要标识因子。据既往研究结果显示[19-21]，毛细支气管炎患儿喘息多次复发的可能率高达85%，日后有可能发展为支气管哮喘。在本文研究中，MUC5AC、TIMP-1表达升高与喘息次数密切相关，可作为毛细支气管炎反复喘息的预测指标仍值得进一步研究。

综上所述，本文研究结果显示，MUC5AC、TIMP-1在毛细支气管炎患儿血清中呈异常高表达，MUC5AC、TIMP-1是毛细支气管发生的影响因素，且其水平升高、喘息次数越多，两者水平与喘息次数呈正相关。但本文研究仍存在不足之处，如样本量小、研究对象单一、病例来源受地域限制，故在今后研究中需增加样本量、纳入多中心研究对象并扩大病例来源范围，以证实本文研究的准确性。