间歇有氧训练激活自噬改善低氧肺动脉高压的肺动脉重构

兰岚，陈阿贞，林文娟，杜建

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPAH) 是一种由慢性缺氧所引起的血管性疾病，是导致肺动脉高压的常见类型，其病理特征表现为肺血管阻力增加及重构。目前，前列环素类、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂是治疗肺动脉高压的推荐药物[1]，但它们并不能预防或逆转疾病的进展，而有氧康复训练作为一种非药物干预手段已成为治疗心肺疾病的重要措施，它对肺动脉高压的治疗十分有益。有氧训练能显著改善肺动脉高压患者的生活质量，一定程度上延缓患者的生存期[2-5]。肺血管重构则是导致HPAH持续进展且不可逆的主要原因，而自噬又与之关系密切。故本研究从自噬调控肺血管重构的角度出发，观察间歇有氧康复训练对HPAH大鼠的疗效，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及实验器材 SPF 级雄性SD大鼠(体质量150～200 g)，购自上海斯克莱斯实验有限责任公司；Beclin-1、LC3 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；增强型RIPA裂解 液、BCA 蛋 白 定 量 试 剂、5×Protein Buffer、彩色预染中分子量蛋白质标准、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液、Western专用一抗二抗稀释液、Western Blotting增强型蛋白印迹再生液、PVDF膜、TBS-T漂洗缓冲液购于博士德生物有限公司。冷冻离心机(JID-17R)购于广州吉迪仪器有限公司；琼脂糖水平电泳仪(DYCP-31DN) 购于北京六一生物科技有限公司；凝胶玻璃板、固定夹、转移槽购于美国Bio-Rad公司；BH2光学显微镜(CX31)购自日本奥林巴斯公司；显微成像扫描仪 (MGU-00003) 购于芬兰GRUNDIUM公司；生物信息采集系统(BL-420F)购于成都泰盟科技有限公司。1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、造模及干预 30只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组、HPAH组及康复组，每组10只。HPAH组及康复组大鼠放置于低氧舱内进行造模[6]。低氧舱内通过充入氮气使舱内的氧浓度保持在9%～11%，CO2浓度控制在2%以下，环境湿度保持在55%～65%，低氧时间为8 h/d，持续4周。

造模完成后，康复组大鼠进行间歇有氧康复训练：将康复组大鼠至于运动跑台，按照10 m/min(10 min)+25 m/min(7 min)+15 m/min(3 min)为一组，每次持续3组，运动时长共计60 min，运动1次/d，持续4周。其余组大鼠放置于静止跑台，与康复组同样时长。

1.2.2 测量平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，MPAP)及右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI) 麻醉大鼠后，用右心导管从颈外静脉插入肺动脉干，使用生物信息采集系统检测MPAP。取大鼠心脏，用质量浓度为0.009 g/mL的NaCl溶液冲洗干净后修剪心脏。去除左右心房、附属大血管及结缔组织，由后室壁间沟处分离出右心室，由室间隔中部剪开分离出左心室，用滤纸吸除残血。分别称量右心室、左心室及室间隔质量，最后计算RVHI＝右心室质量/(左心室质量+室间隔质量)×100%。RVHI是常用衡量肺动脉高压的指标之一。

1.2.3 HE染色 常规分离大鼠肺脏，置于10%福尔马林溶液中，按序进行包埋、切片、脱蜡、苏木精和伊红染色、酒精梯度脱水、风干、封片。采用光学显微镜观察每张肺组织切片的形态学特征。每组各有5张切片标本，每张标本随机选取5个视野进行观察比较。应用Image J软件测量肺小动脉管 壁 厚 度(medial-wall thickness，MT)、血 管 外 径(external diameter，ED)。计算肺小动脉重构的量化指标MT%=MT/ED×100%。

1.2.4 Western blot法检测Beclin-1、LC3蛋白表达

提取大鼠肺组织标本，提取总蛋白并测定浓度。取等量蛋白样品上样，进行凝胶电泳，转膜至PVDF膜，放置于5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，次日经TBS-T漂洗后加入二抗孵育1 h，再次漂洗后使用化学发光成像仪进行曝光成像。以GAPDH为内参，使用BandScan软件测定各条带的灰度值。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 间歇有氧训练对低氧肺动脉高压大鼠MPAP、RVHI的影响 对照组、HPAH组、康复组MPAP分别 为(12.52 ±2.60)mmHg、(40.41 ±3.97)mmHg、(26.14±4.21)mmHg (1 mmHg＝0.133 kPa)。对照组、HPAH 组、康 复 组 大 鼠RVHI 分 别 为(21.37±3.75)%、(47.92±5.57)%、(28.09±4.43)%。与对照组 相 比，HPAH 组 大 鼠 的MPAP、RVHI 明 显 升 高(P＜0.05)。与HPAH组相比，康复组大鼠的MPAP、RVHI水平明显降低(P＜0.05)，见图1。

图1 各组大鼠的MPAP 及RVHI

2.2 间歇有氧训练对低氧肺动脉高压大鼠肺小动脉结构的影响 对照组大鼠肺小动脉血管内膜完整，平滑肌层及血管管腔正常。而HPAH 组大鼠肺小动脉血管内膜不完整，管壁增厚，管腔变窄，平滑肌细胞排列紊乱。经过运动康复干预后，大鼠肺小动脉管壁较HPAH 组变薄，管腔大小接近对照组，动脉内膜相对完整，见图2。

图2 HE染色下三组大鼠的肺脏病理学改变

同时检测肺血管重构的量化指标MT%。结果表明，与对照组(29.38±3.07%)相比，HPAH组大鼠肺小动脉MT%(51.77±4.44%)明显升高，提示肺小动脉管壁增厚。而与HPAH组相比，康复组大鼠MT%(40.07±2.95%)明显下降。以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 各组大鼠肺血管重构量化指标（MT%)

2.3 间歇有氧训练对低氧肺动脉高压大鼠肺组织自噬标志性蛋白Beclin-1、LC3表达的影响 与对照组相比，HPAH组大鼠肺组织Beclin-1、LC3表达明显增加(P＜0.05)；而给予间歇有氧训练治疗4周后，康复组大鼠肺组织Beclin-1、LC3蛋白表达进一步升高(P＜0.05)，见图4。

图4 各组大鼠Beclin-1、LC3蛋白表达情况

续图4 各组大鼠Beclin-1、LC3蛋白表达情况

3 讨论

HPAH是一种长期暴露在低氧环境中所引起的以肺血管重构与阻力增加为特征的血管性疾病，也是慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心脏病、高原性肺动脉高压等多种心肺疾病发生发展的重要病理环节，它最终会导致不可逆转的右心衰竭，具有较高的病死率。目前治疗HPAH的各类药物均不能预防或逆转疾病的进展。运动疗法作为防治心肺疾病的重要手段，尤其是一定强度的间歇有氧运动训练可有效改善心肺各项生理功能、增加运动耐力、提高生活质量[2-5]。本研究也证实了间歇有氧康复训练可减轻肺动脉高压所引起的右心室肥厚，减轻病理损伤，故可成为治疗HPAH的有效方法。

缺氧可导致肺血管持续性收缩，进而发生肺血管内皮细胞受损、平滑肌细胞增殖、外膜纤维组织增多，从而引起肺血管重构[7-10]。肺血管重构是HPAH的主要病理过程，也是其持续进展的主要原因。各种干预方法若能预防和改善肺血管重构，则可以延缓病程进展、延长生存期、降低死亡率。本研究通过观察肺组织HE染色切片发现，与正常大鼠相比，低氧导致肺小动脉血管壁和平滑肌肌层增厚、血管内膜受损、血管腔变窄，提示低氧导致肺血管重构，证实了HPAH的病理特征。而经过间歇有氧康复训练可缓解血管重构的情况，较少肺损伤程度。

自噬是真核生物细胞在压力条件下的自我适应机制。自噬可通过溶酶体途径将受损蛋白质、细胞器或入侵人体内的病原体等进行降解并回收利用。正常的自噬有助于维持细胞稳态，而缺氧、炎症反应、能量缺乏、氧化应激等多种因素则会引发异常自噬，从而打破机体细胞代谢平衡，从而导致细胞受损、凋亡而诱发疾病[11]。自噬参与了多种肺部疾病的发生与发展，其中与肺动脉高压的病理过程关系密切。有研究表明，适当的自噬能抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮屏障，维持正常的血管张力，从而抑制肺动脉高压的形成[12]。但过度自噬则会导致肺血管持续收缩，血管内膜受损，微血栓形成，血管壁平滑肌细胞过度增殖，从而加重肺血管重构，促进肺动脉高压进展[13]。这可能与自噬在肺动脉高压进展的不同阶段而起着不同作用相关。

自噬的发生与多种蛋白的表达变化相关。其中Beclin-1是在哺乳动物中发现的第一个参与自噬的特异性基因。Beclin-1含有BH3蛋白结构域，BH3可介导Beclin-1与Bcl-2/Bcl-xl形成复合体抑制自噬。当机体发生缺氧等情况，BH3结构域被破坏，Beclin-1 与Bcl-2/Bcl-xl 复 合 体 解 离，进 而Beclin-1参与到自噬小体的形成，故其表达强度与自噬程度呈正相关[14-15]。LC3是一种细胞质蛋白，分为Ⅰ型和Ⅱ型。当自噬发生时，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合向LC3Ⅱ转化，促进自噬小体形成，故LC3亦是目前公认的自噬体标志物[16-17]。因此本研究选取Beclin-1、LC3这两个自噬相关蛋白来观察自噬程度，证实了Beclin-1、LC3在HPAH中的表达增加，这与其他学者的研究结果一致[18-20]。同时发现经间歇有氧康复训练治疗后，Beclin-1、LC3的表达较HPAH组均进一步升高，提示通过间歇有氧康复训练可促进缺氧诱导的肺动脉高压大鼠的肺组织发生细胞自噬，以降低肺血管重构。

综上所述，间歇有氧康复训练具有促进自噬而改善肺动脉损伤、减轻肺血管重构、降低肺动脉压力，对HPAH起到保护作用。本研究可为推广运动康复治疗提供参考。