基于PCA-熵权TOPSIS法的汉中天麻外观性状与成分含量综合评价研究*

张远帆,王尚涛,莫 可,秦梦圆,赵生波,李菊艳,张 伟,张子龙,孙志蓉**

(1.北京中医药大学中药学院,北京 102488;2.宁强天麻研究所有限责任公司,陕西汉中 724400;3.宁强县发展和改革局科技开发中心,陕西汉中 724400;4.宁强县中药材产业发展中心,陕西汉中 724400)

天麻为兰科(Orchidaceae)植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥块茎,具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络之功效,对头晕头痛、镇静催眠、癫痫抽搐等有显著疗效。天麻的主要产地分布在云南、湖北、贵州、陕西、安徽、四川等地[1,2],其中陕西省汉中市为西天麻的道地产区,所产天麻大多为红天麻(G.elataBl.f.elata)[3]。汉中天麻主要产自宁强县、勉县和略阳县,不同产地天麻的产量和质量有所不同,故本研究采集了以上3个地区的红天麻作为研究材料进行测定与分析。

药材的外观性状,如形状、颜色、气味等,往往与其内在质量密切相关,但主观评判的标准难以统一。如今,借助电子感官仪器可以将药材外观特征量化,使评判更加客观与直观,为药材质量与视觉、嗅觉等信息的联系提供了可行性[4,5]。在市场中,人们普遍依据天麻外观性状对其质量进行评判,但是人为评判的主观性过强,缺乏准确性[6-8]。电子鼻与分光测色仪可以准确、客观地量化药材气味与颜色,常用于中药材的鉴别与质量评价[9-12]。《中华人民共和国药典(一部)》(2020年版)(以下简称2020年版《中国药典》)对天麻药材中水分、浸出物、天麻素(Gastrodin)和对羟基苯甲醇(P-hydroxybenzylalcohol)的含量做了明确要求[2],另外巴利森苷(Parishins)在天麻中具有显著药理活性且含量丰富[13],所以本研究选择以上指标进行化学成分含量测定。

主成分分析(PCA)法是一种降维数据的多元统计分析方法,在中药研究中应用广泛[14-16]。赵梦利等[17]利用PCA法对鸡血藤(SpatholobiCaulis)饮片数据降维以观察差异。巫晓霞等[18]利用PCA法对不同产地茯苓进行质量评价。熵权TOPSIS(Technique for Order Preperence by Similarity to an Ideal Solution)法可充分利用原始数据,且可以排除主观因素的干扰,更客观地筛选出综合功能特性优良的样本,适用于中药质量综合评价[19-21]。高伟城等[22]利用熵权TOPSIS法对不同产地枇杷叶质量进行综合评价,李雨昕等[23]、史丛晶等[24]利用熵权法的灰色关联法-TOPSIS法分别对不同产地生品、蒸品三七,知母及盐知母进行质量评价。本研究将PCA法和熵权TOPSIS法相结合,先利用PCA法提取主成分,再通过熵权TOPSIS法计算权重并排名,能有效减少冗余的评价指标,提高多指标评价的直观性与科学性[25,26]。

综上,本研究对在陕西省汉中市宁强县、勉县和略阳县采集到的天麻样品进行外观性状、气味、颜色、含水量、浸出物和主要有效成分含量测定,在传统形状指标与生物量的基础上,结合感官量化指标与有效成分含量,利用PCA法结合熵权TOPSIS法对天麻质量进行综合评价,探讨各指标在天麻质量评价中的贡献,为汉中天麻质量标准建立及天麻资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于2020年10-11月在陕西省汉中市宁强县、勉县、略阳县采集27份红天麻,经北京中医药大学孙志蓉教授鉴定为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的块茎。清洗后统一加工、粉碎,过65目筛,备用。样品信息见表1。

表1 天麻样品信息

1.2 仪器与试剂

小型粉碎机(CK-20,北京金洋利科技发展有限公司),电磁炉(21FS37-20110632,九阳股份有限公司),数显游标卡尺(DL91150,得力集团有限公司),鼓风干燥箱(DHG-9123A,上海一恒科技有限公司),分光测色仪(CM-5,日本柯尼达美能达公司),超快速气相电子鼻(HeraclesⅡ,法国Alpha Mos公司),自动进样器(HS-100,法国Alpha Mos公司),高效液相色谱仪(2498,美国Waters科技有限公司),C18色谱柱(X Bridge,美国Waters科技有限公司),十万分之一电子天平(XS205,梅特勒-托利多仪器上海有限公司),电热恒温水浴锅(HH-4A,国华仪器制造有限公司),数控超声波清洗器(KQ-500DE,昆山市超声仪器有限公司)。

天麻素对照品(B21243,纯度≥98%),对羟基苯甲醇对照品(B20326,纯度≥98%),巴利森苷A、B、C、E对照品(B20923、B20912、B2091、B20914,纯度≥98%),以上6种对照品均为上海源叶生物科技有限公司生产;乙腈、无水乙醇、磷酸(色谱级,Thermo Fisher Scientific公司);纯水(娃哈哈饮用纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 外观形状与生物量测定

采集的鲜天麻除去腐坏、虫蛀、不完整的块茎,洗去外部泥土,待表面水分晾干后,观察记录天麻的螺环纹数,测量天麻块茎的长度、宽度,称量鲜重,再将其蒸至内无白心,冷却至室温后放入烘箱,55 ℃烘干后称量干重。

1.3.2 颜色色度值测定

用分光测色仪进行颜色测定。测定波长为350-750 nm;测定口径为8 mm;光源为脉冲氙灯;标准偏差ΔE*ab≤0.4;数据处理软件为Spectra Magic NX。称取天麻粉末适量,置于分光测定仪的培养皿中,平行测定3次,查看并记录色度空间的明亮度(L*)、红绿色(a*)、黄蓝色(b*),由公式(1)求得总色度值E*:

(1)

1.3.3 气味响应值测定

天麻样品用高速粉碎机粉碎后,过24目筛,取上部较粗颗粒,按表2的条件进行检测。

表2 电子鼻测定参数

1.3.4 水分和浸出物含量测定

水分含量参照2020年版《中国药典》通则中的水分测定法(通则8302第二法 烘干法)测定。浸出物含量参照2020年版《中国药典》通则中醇溶性浸出物测定下的热浸法(通则2201)测定。

1.3.5 天麻素和对羟基苯甲醇含量测定

①色谱条件。色谱柱:Waters X Bridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,0.05%磷酸溶液为流动相B,A:B(3:97)等度洗脱;检测波长:220 nm;理论塔板数不低于5 000。

②对照品溶液的制备。取天麻素和对羟基苯甲醇对照品适量,精密称定,加乙腈-水(3∶97)混合,制成天麻素53 μg/mL、对羟基苯甲醇28 μg/mL的混合溶液,超声使其充分溶解,即得。

③供试品溶液的制备。精密称定过65目筛的天麻粉末2 g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%稀乙醇50 mL,称重,超声处理(功率120 W,频率40 kHz)30 min,放冷,称重,用50%稀乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 mL,放置水浴锅中浓缩近无醇味,加入乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解,转移至25 mL容量瓶中,用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度,摇匀滤过,取续滤液,备用。

④标准曲线的建立。分别取5、10、15、20、25 μL的标准品溶液,按照天麻素和对羟基苯甲醇含量测定的色谱条件测定分析,以峰面积为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),得到线性回归方程,标准曲线见表3。

表3 天麻素和对羟基苯甲醇的标准曲线

⑤样品含量测定。精密吸取对照品和供试品各10 μL,按照1.3.5节①的色谱条件测定,得到天麻素和对羟基苯甲醇的峰面积并计算二者含量。

1.3.6 巴利森苷类成分含量测定

①色谱条件。色谱柱:Waters X Bridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱,具体见表4;流速:0.8 mL/min,柱温:30 ℃;检测波长:220 nm;理论板数不低于5 000。

表4 梯度洗脱程序

②对照品溶液制备。取巴利森苷A、B、C、E对照品适量,精密称定,加50%甲醇混合溶液制成巴利森苷A 97 μg/mL、巴利森苷B 65 μg/mL、巴利森苷C 30 μg/mL、巴利森苷E 50 μg/mL的混合溶液,适当超声溶解后,得到对照品溶液。

③供试品溶液的制备。取天麻药材粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,超声处理(功率500 W,频率40 kHz) 30 min,放冷,摇匀,滤过,量取续滤液,备用。

④标准曲线的建立。分别取5、10、15、20、25 μL的标准品溶液,按照色谱条件测定分析,以峰面积为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),得到线性回归方程,标准曲线见表5。

表5 巴利森苷A、B、C、E的标准曲线

⑤样品含量测定。吸取对照品和供试品各10 μL,按照1.3.6节①的色谱条件测定,得到巴利森苷A、B、C、E的峰面积并计算各巴利森苷的含量。

2 结果与分析

2.1 不同产地天麻的外观形状与生物量

27份汉中天麻的块茎长、块茎粗、螺环纹数、鲜重与干重分别为77.6-160.0 mm、26.3-60.8 mm、11-19条、50.0-235.0 g、8.2-37.1 g,略阳县天麻的各项指标均值最高,分别为135.5 mm、51.4 mm、16.6条、176.0 g、27.3 g,运用SPSS 20.0以及Excel 2020进行数据分析以及图表制作,其中各地区天麻块茎长均值无显著差异,略阳县天麻在块茎粗、鲜重、干重均值上与宁强县天麻有显著差异,与勉县天麻差异不显著,勉县天麻与宁强县天麻差异不显著,见图1。由图2,勉县天麻的螺纹环数与宁强县天麻、略阳县天麻差异显著,宁强县天麻的螺纹环数与略阳县天麻差异不显著。

图1 不同地区天麻形状指标

图2 不同地区天麻螺环纹数

2.2 不同产地天麻的颜色色度值

27份汉中天麻的L*和E*值变化明显,如表6所示,二者均为勉县>略阳县>宁强县,说明勉县天麻在外观上比宁强县、略阳县天麻明亮,总色度值较高;勉县天麻的L*值较大,平均值为86.68,外观明亮度较高。a*值以宁强县较高,b*值以略阳县较高,说明通过色度值大小可以区分汉中市不同地区的天麻。结合图3,可以发现不同地区天麻色度值变化趋势不同,其中L*和E*值变化最为明显,说明不同地区红天麻的外观颜色明亮度和总色度值存在差异。

图3 不同地区天麻色度值热点图

表6 不同地区天麻色度值

2.3 不同产地天麻的气味响应值

27份汉中天麻的电子鼻气味分析如图4所示,不同地区天麻的气味响应值根据产区的不同,在峰形一致的基础上,峰强度有一定差异。

图4 不同地区天麻电子鼻气相色谱图

可根据气味响应值将汉中市不同地区天麻大致区分为4类(图5),宁强县大部分天麻样品主要聚为一类,分布在黄色和绿色区域;勉县、略阳县天麻则在各个分类中均有分布,大部分聚集在蓝色区域。3个地区天麻样品的分布未见明显规律,聚类分析中代表点相对分散,气味响应值特征点较为相似。

图5 不同地区天麻气味响应值的聚类分析

2.4 不同产地天麻的成分含量

2.4.1 水分和浸出物含量

汉中天麻的水分、浸出物含量均达到了2020年版《中国药典》标准(图6)。各地区天麻的水分含量为5.6%-9.4%,浸出物含量为15.4%-28.3%,其中,略阳县天麻水分、浸出物含量均值最高,分别为8.0%和22.0%。

图6 不同地区天麻水分、浸出物含量

2.4.2 天麻素和对羟基苯甲醇含量

由图7可知,不同地区天麻的天麻素含量为0.13%-0.65%,其中宁强县天麻的天麻素平均含量最高,为0.35%。不同地区天麻的对羟基苯甲醇含量为0.02%-0.38%,其中勉县天麻的对羟基苯甲醇平均含量较高,为0.20%。不同地区天麻的天麻素和对羟基苯甲醇的总含量为0.26%-0.68%,均达到了2020年版《中国药典》规定标准,宁强县天麻的2种主要有效成分平均总含量最高,达到了0.44%。此外,勉县天麻的对羟基苯甲醇和天麻素的含量接近,2种成分含量比例和其他地区差异显著。

图7 不同地区天麻2种主要化学成分含量

2.4.3 巴利森苷类成分含量

不同地区间天麻中巴利森苷E、B、C、A含量测定结果如图8所示,不同地区天麻巴利森苷E、B、C、A均值含量均为宁强县天麻最高,分别为7.65、5.87、2.10和10.67 mg/g,总含量为26.30 mg/g。

图8 不同地区天麻巴利森苷E、B、C、A成分

2.5 PCA-熵权TOPSIS综合评价体系建立

利用PCA选取质量评价主成分,结合熵权法算得权重后,通过DPS数据统计软件采用TOPSIS法对天麻样品整体质量进行综合评价排名。

2.5.1 PCA提取主要指标

选择外观性状指标:块茎长、块茎宽、鲜重、干重、螺环纹数、色度值(L*、a*、b*、E*);气味响应值指标:15、17、18、24 s峰值;化学指标:水分、浸出物、天麻素、对羟基苯甲醇,巴利森苷E、B、C、A含量共21个指标。根据各指标差异系数以及相关性最终选出16个指标建立评价体系,数据标准化后进行主成分分析,如表7、表8所示。

表7 天麻外观性状及气味响应值标准化数据

表8 天麻化学指标标准化数据

对各项指标数据进行KMO和Bartlett检验,KMO值为0.586>0.5,P<0.05,说明数据适宜进行主成分分析。如表9所示,提取出6个主成分,累计方差贡献率达到82.415%,代表了绝大部分原始指标信息。由表10可知,第1个主成分中,块茎长、块茎粗、鲜重、干重载荷值较大,因此第1主成分可作为形状与生物量的综合体现,定性为形状与生物量因子;同理,第2个主成分中巴利森苷E、B、C、A载荷值较大,定性为巴利森苷类因子;第3个主成分中气味响应值载荷值较大,定性为气味因子;第4个主成分中天麻素载荷值较大,定性为天麻素因子;第5个主成分中水分载荷值较大,定性为水分因子;第6个主成分中颜色值载荷值较大,定性为颜色因子[27]。

表9 天麻质量评价指标的特征值和累积方差贡献率

表10 主成分在各评价指标上的因子载荷矩阵

如表11所示,将载荷系数除以对应特征根的平方根,得到主成分特征向量,构建主成分函数[以形状与生物量因子为例,式(2)],并求得主成分矩阵[28]。

表11 主成分特征向量

Fshape &biomass=0.268×C1+0.391×C2+0.399×C3+0.370×C4-0.193×C5-0.180×C6-0.030×C7+0.200×C8+0.088×C9+0.252×C10-0.234×C11+0.081×C12-0.033×C13-0.272×C14-0.312×C15-0.253×C16。

(2)

2.5.2 熵权TOPSIS法

运用熵权法[29]计算主成分矩阵权重(表12),结合DPS统计软件进行TOPSIS分析。其中,颜色因子、巴利森苷类因子和气味因子所占权重较大,说明上述指标对评价结果影响较大。表13为评价结果,从中可以看出宁强县、略阳县天麻综合质量较优。

表12 熵权法主成分矩阵权重

表13 综合得分排名

3 讨论

本研究在天麻传统性状指标的基础上,结合有效成分含量以及颜色、气味的定量数据对汉中不同地区天麻进行了比较分析与质量评价。在综合评价中为了有效消除主观影响,本研究运用PCA-熵权TOPSIS法构建了天麻质量综合评价体系[30],且筛选出了3个重要评价指标,但由于在略阳县、勉县采集的样品较少,天麻样品范围存在局限性,还需进一步完善与验证。

在外观性状上,3个地区所产天麻的块茎粗、螺环纹数、鲜重和干重均有一定的差异;颜色明亮度和总色度值有一定差别,通过色度值大小可以区分汉中市不同地区的天麻;不同地区天麻样品的气味响应值特征点较为相似。与李巧玲等[30]研究的不同产区天麻相比,汉中3县红天麻与湖北宜昌、安徽岳西、重庆南川红天麻块茎长度相近。略阳县红天麻鲜重及干重、勉县红天麻鲜重较安徽岳西红天麻低,较湖北宜昌、重庆南川高。宁强县红天麻鲜重较安徽岳西、重庆南川低,较湖北宜昌高。勉县红天麻干重较安徽岳西低,较湖北宜昌、重庆南川高。宁强县红天麻干重较安徽岳西低,较湖北宜昌高,与重庆南川相近[31]。

在化学成分上,汉中天麻中水分、浸出物含量均符合2020年版《中国药典》标准,宁强县天麻的天麻素和对羟基苯甲醇的总含量在3县天麻中最高,平均总含量达到了0.44%,勉县、略阳县总含量为0.40%左右,与其他文献研究结果基本一致[32,33]。勉县天麻中天麻素和对羟基苯甲醇含量接近,2种成分含量比例和其他地区差异显著。3县天麻中宁强县天麻的巴利森苷E、B、C、A及总含量均为最高。与张卫等[33]研究的贵州天麻相比,汉中3县红天麻水分含量与贵州红天麻相近,浸出物含量更低。与薛华丽等[34]研究的雪峰山区域不同产地天麻相比,汉中3县红天麻浸出物含量与湖南洪江、溆浦以及湖北罗田等地红天麻相近,天麻素及对羟基苯甲醇总含量与湖南红天麻相似,较湖北红天麻含量高。此外,与周媛等[35]研究的安徽金寨红天麻相比,汉中3县红天麻的天麻素含量较低,对羟基苯甲醇、巴利森苷E含量较高;宁强县红天麻的巴利森苷B含量较高,勉县、略阳县红天麻较低;巴利森苷C含量方面,宁强县红天麻与安徽金寨天麻相近,勉县、略阳县较低。与王庆等[36]研究的西南不同产区红天麻相比,宁强县红天麻的天麻素含量较云南昭通、四川广元红天麻低,较贵州大方红天麻高,与贵州德江红天麻相近,勉县、略阳县较低;对羟基苯甲醇含量方面,勉县红天麻较高,宁强县、略阳县红天麻较四川广元红天麻低,较贵州德江红天麻高,与云南昭通、贵州大方红天麻相近。

田孟华等[37]表示可将巴利森苷A、巴利森苷E作为乌天麻(G.eletaBl.f.glaucaS.Chow)与其他天麻品种差异性分析的标志物。巴利森苷类化合物有生理活性和多种药理作用,且与天麻素之间存在相互转化的关系[4,13],间接提高天麻素含量。张琦[5]在分析引种前后天麻6种主要活性成分含量变化时,发现引种后天麻中天麻素、巴利森苷A、B、C含量有明显的相关性。由此可见,在对天麻开展质量评价时,可将巴利森苷类成分含量纳入评价指标。在本研究建立的评价体系中,颜色因子、气味因子、巴利森苷类因子权重较大,说明在质量评价中应重视上述指标。

4 结论

本研究采用PCA结合熵权TOPSIS法对汉中天麻整体质量进行了综合评价,探究了天麻外观性状与内在成分指标所占权重,发现颜色、气味、巴利森苷类因子权重较大,应注重上述指标在质量评价中的重要性,在此评价体系下,宁强县、略阳县天麻排名靠前。本研究为天麻质量评价提供了参考,也为进一步的分析研究提供了理论基础,从而使评估天麻质量的因素可以被更加科学地把握。