二肽类代谢物生物学功能及分析方法研究进展

唐少冉，周煦婷，侯晓莹，杨柳,3，许风国*，张培*

(1.中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009;2.江汉大学医学院，武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056;3.江苏省肿瘤医院，江苏 南京 210009)

二肽由两个氨基酸分子通过肽键连接形成，平均分子量约260 Da。二肽组成简单但结构多样，仅20个构成蛋白质的基本α-氨基酸就可组成400个二肽。除此之外，体内尚有多达数百种非必需氨基酸亦可作为二肽的组成单元。现有研究认为，人体内的二肽类代谢物主要来源于膳食摄入后的蛋白质消化吸收和内源性蛋白降解，广泛存在于体液、细胞和组织等生物样本中[1-2]。此外，体内还有一部分二肽由两分子游离氨基酸通过酶促反应缩合而成[3-4]。二肽在体内发挥着重要的营养学功能和生物学功能，近年来有研究报道，二肽还可作为肺癌、结肠癌和肝癌等疾病诊断和分型的潜生物标志物[5-7]。二肽是机体内一类重要的内源性小分子代谢物，分布广泛、种类繁多、功能多样，近年来逐步引起人们的关注。但同分异构体多、浓度范围广、标准品缺乏也给二肽类代谢物的定性定量分析、生物学功能研究带来巨大挑战。

1 二肽的转运吸收

1.1 吸收 人体内二肽类代谢物主要来源于消化道吸收。过去研究认为，蛋白质经消化道酶促水解后，全部以氨基酸的形式被肠道吸收[8]。随后的研究揭示，人体吸收蛋白质的主要形式还包括寡肽，尤其是二肽和三肽，以寡肽形式的蛋白吸收率相比于氨基酸提高了2～2.5倍，这是人体胃肠道吸收蛋白质机制研究的重大突破[9-11]。吸收进入细胞的二肽一部分被胞浆中的肽酶水解后形成游离氨基酸，用于细胞本身代谢合成或被基底侧的氨基酸转运系统运至体循环；另一部分具有抗水解酶活性的二肽则可直接通过基底侧的肽转运体被完整地转运至体循环，之后被血浆中的可溶性蛋白酶降解为氨基酸(见图1)[12-14]。

1.2 转运 寡肽转运载体(POTs)家族中的PepT1(SLC15A1)、PepT2(SLC15A2)、PHT1(SLC15A4)和PHT2(SLC15A3)是目前已知的人体内二肽类代谢物的转运体。关于PepT1和PepT2研究较多，而对PHT1和PHT2研究则较少，其具体功能尚不清楚。PepT1是低亲和力、高容量的肽载体，主要在小肠上皮细胞中表达。二肽通过PepT1穿过肠上皮，最终进入血液循环、器官及细胞组织，迅速发挥生理作用[15]。PepT2是高亲和力、低容量的肽载体，主要在肾髓质细胞和上皮细胞的刷状缘膜侧表达中表达，可以重吸收肾小球滤过的二肽[16-17]。二肽转运系统主要是pH依赖性的H+-Na+交换转运体系(见图1)。在转运过程中H+向细胞内电化学质子梯度供能，质子向细胞内转运产生的动力驱使二肽以易化扩散的形式进入细胞，引起胞浆的pH值下降，进而活化Na+-H+通道，H+被释放出细胞，细胞内的pH恢复到初始水平[18]。除二肽转运体外，一部分二肽可通过细胞旁途径穿过肠上皮膜，直接通过上皮细胞之间的紧密连接(tight junctions)进入细胞间隙而被吸收[19]。研究发现，二肽转运体更倾向于运输带有中性电荷的极性疏水二肽，而亲水性、中性或带负电荷、小分子量二肽则更易经紧密连接的胞外通路运输[12]。

图1 二肽转运吸收示意图

2 二肽的生物学功能

2.1 营养调节作用 二肽与游离氨基酸的吸收分别依赖于各自的蛋白转运体进行(见图1)，既相互独立又互为补充。吸收进入细胞的部分二肽可以水解成游离氨基酸，有助于减弱由于游离氨基酸之间相互竞争共同吸收位点而产生的拮抗作用，增加细胞内氨基酸吸收量，加速蛋白质合成，从而发挥营养调节作用。Paulussen等[20]研究了Leu-Leu摄入后对餐后肌肉蛋白质周转代谢的影响，Leu-Leu通过刺激人体中肌纤维蛋白质的合成，从而提高血浆中Leu-Leu的浓度以及肌肉蛋白质的周转率。Mantuano等[21]对Ala-Ala作为营养补充剂对骨骼肌萎缩的影响进行了研究，发现Ala-Ala可以增加支链氨基酸的生物利用度，改善肌肉萎缩。另有研究表明，添加Gln-Gln强化的肠外营养，可以改善重症患者的预后，显著降低重症患者的感染率及住院时间[22]。

2.2 生理调节作用

2.2.1 促细胞增殖 已有研究揭示，蛋白质水解产生的某些二肽具有促细胞增殖的作用。成纤维细胞在伤口愈合中发挥重要作用，其能形成肉芽组织，合成胞外基质化合物。研究发现，小鼠皮肤伤口愈合处内源性胶原蛋白降解可产生Pro-Hyp，Pro-Hyp能促进附着在胶原蛋白上的成纤维细胞的生长[23]。Hyp-Gly也被证实具有促成纤维细胞增殖的功能[24]。另外，Pro-Hyp还可以提高海马内脑源性神经营养因子和神经生长因子的基因表达，促进海马神经细胞增殖，从而发挥抗抑郁活性[25]。除上述来自胶原蛋白水解的含有Hyp的二肽外，Tyr-Gly也被证实具有促进人外周血淋巴细胞增殖的作用[26]。

2.2.2 抗炎活性 炎症是生物组织受到某种刺激如外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。一般情况下，炎症是有益的，但过度炎症反应则会造成机体损伤，并且炎症与癌症的发生发展密切相关。研究发现，多种二肽具有抗炎活性。Ano等[27]报道，口服Trp-Met可以抑制阿尔茨海默症模型小鼠大脑炎症反应，推断可能是Trp-Met口服后被输送到大脑，通过抑制脑内单胺氧化酶B的活性，从而抑制大脑中的炎症反应。Engevik等[28]报道，TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution)诱导的结肠炎小鼠灌胃给予γ-Glu-Cys后，组织中促炎细胞因子水平显著降低，提示该二肽具有抗炎活性。El-Lekawy等[29]研究了Ala-Gly对胃溃疡大鼠的作用效果，结果显示Ala-Gly可以使NF-κB p65失活发挥其抗炎作用，从而促进胃溃疡愈合。Cruzat等[30]研究发现，内毒素血症小鼠口服Ala-Gln后，体内的谷氨酰胺的利用度显著增强，证实Ala-Gln通过抑制NF-κB通路发挥抗炎作用。

2.2.3 神经类活性 二肽可以作为神经递质通过间接刺激肠道受体激素或酶的分泌而发挥作用。肌肽是一种组氨酸二肽，被认为可能是嗅觉受体神经元中的一种的神经递质[31-32]。研究发现，肌肽可以刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而发挥类似兴奋剂样作用[33]。Tyr-Trp可以增强去甲肾上腺素的合成和代谢，并可以改善由β-淀粉样肽(25～35)所致小鼠学习记忆障碍[34]。此外，芳香二肽也具有神经类活性，如 Tyr-Arg、Tyr-Leu、Phe-Leu 和Trp-Leu表现出较强的抗焦虑活性[8,35-36]。Tyr-Arg还具有镇痛作用[35]，Tyr-Leu具有抗抑郁作用[37]。

2.2.4 降血压活性 研究表明，从沙丁鱼肌肉水解液中提取的二肽Val-Tyr、Val-Trp、Ile-Tyr和Ile-Trp均有降血压作用[38-40]。进一步的机制研究发现[41]，Val-Tyr主要通过抑制肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素转换酶发挥降血压作用。

2.2.5 降血脂活性 Aldini等[42]发现肌肽具有显著降血脂活性，能够降低肥胖Zucker大鼠的肥胖相关疾病(高血脂、高血压、糖尿病和肥胖性肾病等)的发生。也有研究表明，人体补充含组氨酸的二肽(如肌肽)可以降低脂肪量，减少中心性肥胖[43]，但是目前肌肽降脂机制尚不清楚。除肌肽外，Trp-Glu也被证实具有降脂作用，其可能机制是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-α增加细胞脂肪酸摄取，从而减少肝细胞中的肝脂积累[44]。

2.2.6 其他作用 除促细胞增殖、抗炎、神经类活性、降血压、降血脂外，二肽亦可发挥多种生物学功能。Matsui等[45]人研究发现，载脂蛋白E基因敲除后动脉粥样硬化小鼠口服Trp-His可有效减轻动脉粥样硬化病变。Khedr等[46]报道，Trp-Leu可以通过调节血管内皮生长因子进而抗血管生成。Nakato等[47]筛选了具有调节胃饥饿素释放的二肽代谢物，发现Leu-Ile和Ser-Val分别表现出最强的胃饥饿素释放抑制和刺激作用，并且Leu-Ile降低了小鼠的血浆胃饥饿素水平，Ser-Val增加了小鼠摄食量(见表1)。

表1 二肽生物学功能汇总表

3 二肽类代谢物的分析

目前用于二肽类代谢物分析的仪器方法有氢核磁共振(1H-NMR)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)和毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等均被报道。LC-MS将液相色谱的高效分离特性和质谱的强大定性和定量优势有机结合，是目前二肽类物质分析中最有潜力且应用最多的分析手段[48]。但由于二肽类代谢物结构的特殊性，LC-MS在二肽类代谢物高灵敏、宽覆盖检测上仍面临巨大挑战。首先，二肽类代谢物浓度范围广(fmol·L-1～mmol·L-1)[1,13,49]，一般质谱的动态范围难以满足分析要求；其次，二肽类代谢物的组成单元中存在互为同分异构体的氨基酸(亮氨酸与异亮氨酸)，且氨基酸连接顺序不同可产生顺序异构体，使得二肽在常规色谱柱上的分离难以实现。目前，基于LC-MS的二肽代谢物分析方法包括非靶向代谢组学、靶向代谢组学、化学衍生化辅助的靶向测定等。

3.1 二肽类代谢物的定性分析 随着高特异性、高灵敏度质谱的兴起和各类离子源的快速发展，二肽的鉴定分析技术愈加成熟。但是二肽自身的质谱信息较为简单，难以产生丰度较高的定性碎片离子进行无歧义结构鉴定，因此研究者多借助化学衍生化来丰富二肽的质谱结构信息。Madmon等[50]采用 LC-ESI-MS/MS技术获取二肽的[M+H]+、[M+Na]+以及二肽氨基甲酸酯衍生化之后的质谱裂解信息，综合多种碎片离子信息对二肽进行结构表征。Poliseli等[51]开发了一种5 min快速LC-ESI-MS/MS分析方法，其基于二肽中羧基的中性丢失46 Da，对乳清蛋白以及猪肝蛋白水解物中的二肽进行鉴定，分别鉴定出18和14种二肽。Tang等[52]利用二甲基标记和未标记二肽的MS/MS图谱比对，对二肽中氨基酸序列进行识别，并建立二肽结构预测的MS/MS图谱数据库。Li等[53]借助激光辅助化学转移技术结合衍生化试剂4-羟基-3-甲氧基肉桂醛对组织中二肽化学衍生化后，使用MALDI-MS对组织中二肽进行原位检测分析，并应用该策略对大鼠脑组织中34种二肽的空间分布进行了表征。

3.2 二肽类代谢物的定量分析 二肽类代谢物定量分析方法按是否衍生化可分为两大类：直接代谢组学分析和基于化学衍生化的靶向测定，而代谢组学分析中又包括非靶向和靶向两种方法。

3.2.1 非靶向代谢组学 很多研究者利用非靶向代谢组学分析方法，在不同疾病模型中，发现了二肽类差异代谢物。Hou等[54]采用UPLC-IT-TOF/MS非靶向代谢组学方法，寻找肠道菌群介导的FOLFOX抗结肠癌疗效个体差异的潜在生物标志物，发现小鼠粪便样本中Phe-Val、Leu-Gln、Ile-Ala在FOLFOX敏感和非敏感个体间存在显著差异。Li等[5]对3 482名志愿者血清样本进行非靶向代谢组学分析，发现Glu-Leu可作为结肠癌早期诊断的生物标志物。Vallianatou等[55]应用UPLC-MS/MS对睡眠期间小鼠大脑的氨基酸及二肽进行非靶向代谢组学分析，揭示昼夜节律与不同大脑区域特有的二肽代谢之间存在显著相关性。

3.2.2 靶向代谢组学 在质谱联用法中可直接对生物样本中的二肽进行定量或半定量分析。然而二肽类代谢物一般极性较大，在反向色谱柱上难以保留，如果对其直接进行LC/MS分离分析，一般会选用对极性化合物保留强的亲水色谱柱或耐水型色谱柱。Ozawa等[1]建立LC-MS/MS和CE-MS/MS两种分析方法应用大于鼠肝脏中335种二肽的定量分析，两种分析方法的结合可对二肽中的同分异构体进行有效分离并准确定量。Nogimura等[25]用LC-MS/MS多重反应监测模式直接对血浆中Pro-Hyp和Hyp-Gly进行了含量测定。

3.2.3 化学衍生化辅助的定量测定 二肽类代谢物一般极性较大，在反向色谱柱上分离困难，不易离子化，而且二肽结构的质谱信息缺乏，难以产生稳定的定量特征碎片离子。在此情况下，科研人员也尝试将化学衍生化技术与LC/MS联用技术结合，将强极性的二肽转化为适于反相色谱分离并易于质谱离子化的化合物。虽然引入化学衍生化使得分析流程复杂、耗时费力且容易引入误差，但对于复杂体系中的特殊性质(如低丰度、难离子化、种类多、浓度范围宽、无内标等)物质的检测往往能实现1+1>2的效果，可以极大提高常规LC/MS整体性能。经化学衍生化之后的二肽色谱保留增强、离子化效率提高、定性定量碎片离子对信息丰富。目前，二肽的衍生化反应主要是针对二肽中的氨基，衍生化试剂有丹磺酰氯(DNSCl)[6]、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯(AQC)[24,49]、三硝基苯磺酸(TNBS)[56]等。不同的衍生化试剂与二肽发生反应的方程式分别如图2所示。

A.DNSCl;B.AQC;C.TNBS

4 结语与展望

二肽类物质结构简单、组成多样、活性繁多，其生物学机制及与疾病的关联值得深入研究。目前对于内源性二肽代谢物研究还处于起步阶段，对其种类、数量及产生过程认识有限，文献报道或数据库收录的代谢物较少且只有极少部分标准品可得，未知代谢物结构难以有效鉴定，二肽类代谢物的高灵敏、宽覆盖定量分析仍然面临诸多挑战。针对二肽类代谢物种类多且结构复杂、标品来源受限的问题，可采用拟靶向代谢组[57]学和一测多评[58]的分析方法，实现基于有限标品的宽覆盖定量测定。针对该类代谢物离子化效率低、质谱响应差的问题，可利用化学衍生化实现高灵敏测定。未来针对该类物质设计反应效率高、衍生化产物稳定性好、质谱增敏效果好的衍生化试剂尤为重要。针对此类代谢物同分异构体的分离分析难题，可考虑采用多维度(保留时间、离子淌度、特征碎片)整合分析方法，改善分离、提高鉴定可信度。随着基础研究和分析方法的快速发展，未知二肽代谢物的发现，二肽的转运吸收、与受体之间的相互作用新机制，二肽在不同疾病中的关键作用发现与验证，将成为未来研究热点。