国产高敏HCV-RNA 定量试剂与国产普敏及进口高敏试剂一致性分析

刘 婷，武建明，姚 亮，佟艳会，戚应杰*

[1.中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）感染病院，安徽 合肥 230000；2.山东见微生物科技有限公司，山东 济南 250100]

丙型肝炎（简称丙肝）病毒（hepatitis C virus，HCV）感染遍及全球，中国约有1 000 万感染者[1-2]，但由于其感染具隐匿性，造成我国HCV 感染的诊断率较低，仍有70%以上的HCV 感染者没有被发现[3]。直接抗病毒药物（direct-acting antivirals，DAAs）可以使90%以上的丙肝患者得到治愈，因此，对丙肝病毒感染者进行正确诊断尤为重要。血清HCV-RNA 检测是确诊HCV 感染的金标准[4]，对于急性HCV 感染窗口期患者、免疫抑制（如艾滋病、恶性肿瘤化学治疗、造血干细胞移植、实体器官移植、血液透析、全身应用糖皮质激素等）患者能有效检出，同时也可作为抗病毒治疗疗效判断的指标，可指导抗病毒治疗及疗效判定[1,5]。但不同厂家试剂核酸提取方法、引物探针特异性及扩增反应体系等都不同，导致试剂敏感度、特异度相差很大，因此对于临床样本的阳性判断、临床诊疗方法的制订、患者停药标准都有差异[4]。近几年，国内外发布的行业指南中就强调在治疗前评估、治疗监测和治疗终点判定，均采用敏感的检查方法（检查下限≤15 IU/mL）检查血清或血浆HCV-RNA[1,5-9]。现阶段国产普敏试剂敏感度无法满足各指南对于检测下限的要求，而进口高敏试剂价格较高，增加了患者的负担，因此国内试剂厂商开发出国产高敏HCV-RNA 定量检测试剂。本研究中对临床样本进行国产高灵敏的HCV-RNA 核酸定量检测试剂与国产普敏HCV-RNA 定量检测试剂的一致性分析，对稀释的低浓度样本进行国产高灵敏的HCV-RNA 核酸定量检测试剂与进口高敏HCV-RNA 定量试剂的一致性分析，现报道如下。

式中：Qc为频率为P的泥石流峰值流量，m3/s；1+Φ为修正系数，据表3取1.919；Qp为频率为P暴雨洪峰流量，m3/s；Dc为堵塞系数，按勘查规范表I.1查表确定。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2021 年1 月至9 月中国科学技术大学附属第一医院临床诊断为丙肝的患者血液标本165 例，所有患者诊断标准符合《丙型肝炎防治指南（2019 年版）》[1]。所选择的患者均为单一HCV 感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病。纳入标准：①有HCV 感染流行病学史；②临床表现：有全身乏力、食欲减退、恶心和右季肋部疼痛等，少数伴低热，轻度肝肿大，部分患者可出现脾肿大，少数患者可出现黄疸；③抗HCV 和（或）HCV-RNA 阳性。排除标准：①其他病毒性肝炎；②自身免疫性疾病合并抗HCV 阳性；③合并其他感染、肿瘤、炎症等疾病。样本离心后保存于-80 ℃。稀释样本制备，方法如下：选择一例临床样本（浓度2.42×104IU/mL，COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HCV test.Version2.0 试剂定量）。采用阴性血清稀释成浓度为（15～500 IU/mL）的样本60 例。本研究已获安徽省立医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

越来越多研究发现Corin存在于许多组织器官中，尤其在心肌组织中表达显著。可激活无活性的利钠肽系统，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，从而发挥排钠利尿、舒张血管、调节血容量及改善心功能等生理作用。目前认为，Corin与心血管疾病(高血压、冠心病、心力衰竭、房颤)的发生发展相关，可作为心血管疾病诊疗及预后的生物学标志物。随着研究进一步深入，Corin可能与心血管疾病相关疾病(肾脏疾病、糖尿病等)存在相关性。将有更多研究探索Corin的生物学及在心血管疾病中作用，为未来将Corin和利钠肽研究结果用于心血管疾病治疗奠定理论基础。

1.2 试剂与仪器试剂A（国产高敏）定量检测系统采用GBead 全自动核酸纯化仪（山东见微生物科技有限公司，鲁济械备20170071 号，型号：GBead），标本用量200 μL；扩增试剂为丙型肝炎病毒核酸检测试剂，配套扩增试剂使用核酸提取试剂盒（山东见微生物科技有限公司，国械注准2019340620）。试剂B（国产普敏）定量检测系统采用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（厦门安普利生物工程有限公司，国械注准20173404605），全自动医用聚合酶链反应（PCR）分析系统GeneLight9820（厦门安普利生物工程有限公司，国械注准20153402340）。两种试剂盒检测方法的基本原理一致，均通过荧光定量PCR 技术进行丙肝患者HCV 病毒载量的检查。扩增仪采用ABI 7500实时荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems 公司，型号：20163220767）。试剂C（进口高敏，罗氏诊断产品有限公司，国械注进20173400863）：COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HCV Quantitative test.Version2.0。三种试剂按照各自说明书进行结果判读，当报告“未检测到靶标”时结果判断为阴性；当报告“

表1 两种HCV-RNA 实时荧光定量PCR 试剂盒特征比较

2.2 试剂A/试剂B 临床样本检测结果比较

2.2.2 一致性分析 165 例样本中试剂A 与试剂B 在检验浓度<500 IU/mL 时，分别是77 例、78 例；浓度在5.0×102～5.0×104IU/mL 时分别是10 例、11 例；浓度在5.0×104～5.0×106IU/mL 分别是69 例、61 例；浓度>5.0×106IU/mL 分别是9 例、15 例，见表4。对于试剂A 与试剂B 定量值均≥500 IU/mL 的样本，采用Bland-Altman 分析试剂A 与试剂B 定量值的差值均值为-0.032 6 log10IU/mL，95%置信区间为（-0.462 6～0.397 4）log10IU/mL，95.40%（83/87）的样本检测值在95%可信区，见图2。但有4 例样本不在95%置信区间内。对这4 例样本进行C试剂复测（表5 b～e 号样本），结果显示试剂A 与试剂C检测的b、c、d、e 样本对数偏差值均小于试剂B 检测的b、c、d、e 样本对数偏差值。

2.1.2 系统精密度 分别检测康彻思坦HCV-RNA 系列血清（液体）标准物质2.2×103IU/mL、4.4×105IU/mL 各10例，计算绝对偏差与变异系数CV，符合试剂A 中性能说明，见表2。

2 结果

因为时代在不断变化，所以“互联网+”模式下的人力资源管理相比较传统的组织结构会发生较大的改变，整体的组织结构会更加扁平化，还可能会有一些新的组织形式不断出现。所以人力资源管理者要不断跟随时代的变化，并且及时进行调整。

2.1.1 系统线性 浓度的理论对数值为X 轴，实测对数值为Y 轴，进行线性拟合，见图1，线性方程为Y=1.011 4X-0.040 4，R2=0.999 9，符合考核试剂盒A 中性能说明。

图1 试剂A 系统线性拟合

1.4 统计学分析用Excel 对数据进行整理，将HCVRNA 病毒载量对数转换（log10IU/mL），通过SPSS22.0统计学软件进行Bland-Altman 模型分析A/B 检测试剂、A/C 检验试剂检测结果的一致性。试剂A/B 检出率进行χ2检验。

表2 试剂A 检测系统精密度

1.3 检测方法样本检测前校准试剂A 与仪器：使用试剂A 检测康彻思坦生物科技有限公司的HCV-RNA 系列血清（液体）标准物质GBW(E)090140、GBW(E)090142，计算线性拟合、绝对偏差和变异系数；将试剂B 检测的165 例血清样本，采用试剂A 进行检测，对在Bland-Altman 分析中两种试剂95%置信区间内的样本，采用试剂C 进行复测；以60 例稀释浓度为50～500 IU/mL 的样本，分别采用试剂A 与试剂C 进行病毒定量检测，各试剂检测方法按照试剂盒说明书标准步骤进行检测。

2.3 试剂A/试剂C 稀释样本检测结果比较

表3 试剂A/试剂B HCV-RNA 核酸检测试剂检测结果比较

一个青年人在思想上是否成熟，要看他是否有自我创造的自觉意识和有效结果，能不能通过自我创造过程，把外来的知识信息、资源条件转换成自我创造的要素，完成社会性自我身心的创造。大学教育与中小学教育相比，青年自我创造的成分越来越突出。如果处在大学教育的关键阶段，缺乏必要的自我创造意识，会是一个严重的问题。以往普遍存在的被动灌输式教育压抑了学生的创造力，使之忘记自己是创造的主体。而没有自我创造的意识，就不能培养人的创造力。我们走向一个新时代，要使中华民族创造力焕发出来，青年在成长中就要培养自我创造的意识。

图2 试剂A 与试剂B 一致性分析

表4 165 例不同浓度样本试剂A 与试剂B 的检出率分布例数/总例数（%）

表5 5 例差异样本试剂A、试剂B、试剂C 检测浓度（log10IU/mL）与对数偏差绝对值

2.2.1 检测结果 本研究中共收集试剂B 检测的血清样本165 例，试剂B 检测结果分布为：低于检测下限即<500 IU/mL 的标本78 例，占47.27%（78/165）；500～5.0×108IU/mL 的标本87 例，检出率52.73%（87/165）。使用试剂A 检测结果分布为：低于检测下限即<15 IU/mL 的标本77 例，占46.67%（77/165）；30～1.0×109IU/mL 的标本88 例，检出53.33%（88/165），见表3。检验统计量χ2=1，小于界值χ20.05,1=3.84，得出P>0.05，可以认为两者检出率差异无统计学意义。但有1 例临床样本试剂B 检测为<500 IU/mL，根据安徽省立医院感染病院试剂B 的检验结果解释，“检验结果<500 IU/mL，判断为阴性或浓度低于检测下限，报告为<500 IU/mL”，但这例样本采用试剂A 检测结果为4.45×106IU/mL。相差较大，因此对这例样本采用进口高敏试剂C 进行复测，结果显示为2.14×106IU/mL（表5 中的样本a）。

2.3.1 检测结果 本研究中以试剂C 检测结果的2.42×104IU/mL 样本，随机稀释浓度为50～500 IU/mL（60例），试剂A 检测结果与试剂C 检测结果分布，见表6。

2.1 试剂A 校准结果对试剂A 采用试剂盒参考品进行线性范围限定，采用北京康彻思坦生物科技有限公司的HCV-RNA 系列血清（液体）标准物质进行准确度验证。

表6 60 例随机稀释浓度样本试剂A 与试剂C 的检出率分布[例(%)]

2.3.2 一致性分析 对于试剂A 与试剂C 定量值均≥500 IU/mL 的样本，采用Bland-Altman 分析，试剂A 与试剂C 定量值差值均值为0.180 0 log10IU/mL，95%置信区间为（-0.090 7～0.450 6）log10IU/mL，96.67%（58/60）的样本检测值在95%置信区间内，见图3。这提示国产高敏试剂A 与进口高敏试剂C 在15～500 IU/mL 浓度内，具有高度一致性。

②晴雯听了这话，不觉又伤起心来，含泪说道：“为什么我出去？要嫌我，变着法儿打发我出去，也不能够。”(第三十一回)

图3 试剂A 与试剂C 一致性分析

3 讨论

HCV-RNA 定量检测试剂已广泛应用于丙肝患者的临床确诊、抗病毒治疗疗效判断中，目前在各临床单位，主要应用的有进口高敏和国产普敏的HCV-RNA 定量检测试剂盒[10]。进口高敏试剂价格以当前各地物价中位数计，为540.5 元，国产普敏试剂价格中位数为135 元，但进口高敏HCV-RNA 检测试剂的敏感度、线性范围等均优于国产普通敏感度试剂，有利于正确指导患者治疗方案的制定和评价疗效[11]。基于诸多因素，开发国产高敏HCV-RNA 检测试剂盒，因其即具有进口高敏试剂在敏感度上的优势，又具有相对低的价格，具有重要的实用意义。

鉴于各试剂厂商试剂与仪器研发能力的差异，国内能开发高敏HCV-RNA 检测试剂盒的厂家并不多。在本次试验中，国产高敏试剂A 分别与国产普敏试剂B 进行了检出率的比较与一致性的分析，虽然检出率上看两种试剂差异无统计学意义，但从其中差异样本复测结果看，可以确定普敏试剂B 漏检了1 例高浓度的阳性样本，导致核酸漏检的原因既可能来自于样本特殊性（如溶血、脂血、药血等），同时也不排除检测过程中的人为误差或系统本身的误差造成。对国产高敏试剂A 与国产普敏试剂B 检测的87例定值样本进行Bland-Altman 一致性分析，试剂A 与试剂B 定量值差值均值为-0.032 6 log10IU/mL，95%置信区间为（-0.462 6～0.397 4）log10IU/mL，95.40%（83/87）的样本检测值在95%置信区间内。但有4例样本不在95%置信区间内。对这4 例样本进行进口高敏试剂C 复测，结果显示国产高敏试剂与进口高敏试剂结果偏差分别为0.69 log10IU/mL、0.30 log10IU/mL、0.07 log10IU/mL、0.21 log10IU/mL，而相同样本国产普敏与进口高敏偏差值分别为1.17 log10IU/mL、0.75 log10IU/mL、0.51 log10IU/mL、0.63 log10IU/mL，显然，国产高敏试剂A 的定量值与进口高敏试剂C 定量值更为接近。HCV 在患者体内具有较高的复制水平，病毒复制动力学与宿主免疫应答的产生存在时间上的差异[12]。因此HCV 病毒确诊患者载量通常很高，虽然窗口期感染者和经治后期患者病毒载量通常很低，但安徽省立医院感染病院作为感染病治疗医院，收治的均是确诊患者，DAA 药物目前持续病毒学应答（Sustained virological response，SVR）已达到90%以上[13]，所以安徽省立医院感染病院实验室遇到≤500 IU/mL 的HCV 临床样本相对较少，因此在进行国产高敏试剂A 与进口高敏试剂C 一致性分析时采用稀释样本（15～500 IU/mL）进行一致性分析，结果显示国产与进口高敏试剂定量值差值均值为0.180 0 log10IU/mL，95%置信区间为（-0.090 7～0.450 6）log10IU/mL，96.67%（58/60）的样本检测值在95%置信区间内，说明国产高敏试剂和进口高敏试剂具有较高的一致性。

由于早期HCV 感染少有临床症状，所以这些患者多数是在进行入院常规检查的时候进行抗体筛查发现的，再由感染科医生会诊，检查HCV-RNA 阳性，来确诊丙肝感染。因此，敏感度高的核酸检测方法，对确诊HCV-RNA阳性尤为重要，否则可能导致患者大量流失。有研究选取14 个省（自治区、直辖市）56 个县区的二级及以上医院进行HCV 诊断及治疗情况分析，显示HCV-RNA 检测率仅为34.9%[14]。治疗方面，近年来由于直接抗病毒（DAA）药物的出现大大提高了治疗率，国内常见的1b、2a 型丙肝患者可得到治愈[15]。因而，确诊HCV 感染、识别无症状感染或者抗-HCV 阴性的HCV 感染者、监测DAA 用药疗效，对HCV-RNA 检查的敏感度提出了更高的要求[16]。鉴于进口高敏感度核酸检测试剂的成本高，而当前国产高敏试剂性能不断提高，因此，建议采用国产高敏感度HCV-RNA 检测试剂进行治疗前评估、治疗监测和治疗终点判定的定量检测。