营养液臭氧消毒频次对水培苗用大白菜（快菜）生长及微生物环境的影响

贾姊薇 王丽萍 季延海 王学瑾 武占会 王素娜 王 星 梁 浩*

（1 河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸 056009；2 北京市农林科学院蔬菜研究所，北京 100097；3 农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 100097）

快菜（Brassica rapavar.glabraRegel）是一种早熟苗用型大白菜，生长速度快，且营养丰富，受到种植户的喜爱。以水培方式进行快菜种植，产量高，品质稳定，便于自动化管理，能够实现周年多茬生产（王丽红，2010）。管道式水培是轻简高效无土栽培方式之一，栽培管道连接营养液储蓄桶，24 h 循环供应营养液，其标准化程度高，叶菜产品接近净菜标准。在蔬菜生产过程中，除了对环境、营养供给等精准调控外，也有必要对循环营养液的微生物环境进行调控（Miller et al.，2013；Fan，2021）。由于反复使用的营养液可能出现有害生物，包括病原微生物（细菌、真菌）、浮游动植物（藻类、原生动物）、线虫等（陈磊夫 等，2020），通过空气、水、种子、基质、器具、人工操作等途径进入栽培系统，生产过程中容易引起营养液环境污染，特别是夏季高温常伴随细菌性病害发生，存在潜在的商品性下降及食品安全风险（Carvajal-Yepes et al.，2019），而目前尚缺乏安全可行的处理方法。前人针对水培或基质栽培系统中病原菌的传播规律做了大量研究，因营养液一直处在循环中，容易滋生细菌等，又因营养液在整个栽培系统中循环，容易导致大面积病害发生，严重时导致整批次作物死亡（王冬华 等，2005）。借鉴李倩（2019）的研究结果可预判病原菌在潮汐式灌溉过程中的发病规律。Runia 和Amsing（1996）在种植玫瑰的苗圃进行试验，使用未灭菌的营养液在岩棉块无土栽培系统中循环利用，结果发现病原体迅速扩散，且玫瑰植株越小越易感染病菌。

臭氧消杀技术是通过外源臭氧气体对营养液进行接触式消灭病原菌（Guo &Wang，2017；袁也等，2019），在控制细菌性病害的同时，多余臭氧分子可快速分解为氧气，无污染、无残留，在合理浓度下不会对植株造成影响（王海明，2005；吕武轩，2006），是一种安全的广谱性消杀方法（宋卫堂 等，2007；刘照启 等，2020）。本试验设计的营养液消毒系统由管道式水培系统、营养液储蓄桶、循环水泵、臭氧发生器组成，以快菜品种京研快菜4 号为试材，采用在循环营养液中通入臭氧曝气的方式（潘剑蕾，2019），研究不同频次臭氧消毒对快菜细菌性病害的抑制作用以及对产量和品质的影响，以期解决水培系统水体微生物环境的潜在危害，为水培净菜生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022 年6—7 月在北京市农林科学院蔬菜研究所的连栋温室内进行。试验期内，温室白天平均温度为34.9 ℃，最高达到43.9 ℃；夜间平均温度为26.5 ℃，最低至19.5 ℃；白天平均空气相对湿度为35.1%，夜间为65.2%；循环营养液白天平均温度为32.4 ℃，夜间为26.9 ℃。

供试快菜品种为北京市农林科学院蔬菜研究所（原北京市农林科学院蔬菜研究中心）培育的京研快菜4 号（余阳俊 等，2013）。将种子点播至充分泡水的海绵块中，暗处理2 d 后放置在盛有营养液的苗床上进行育苗；幼苗四叶一心期定植于管道式水培架上，管道式水培系统如图1 所示。臭氧发生器购自青岛奥宗尼尔净化设备有限公司，型号为SW-003-30G，臭氧输出量为30 g·h-1，功率为350 W，输出端配置曝气头；该臭氧发生器是利用雷击放电产生臭氧的原理，以空气为原料，采用沿面陡变放电技术释放高浓度臭氧，曝气时臭氧浓度达到20 mg·m-3。营养液使用北京市农林科学院蔬菜研究所研发的无土栽培营养液改良配方，并使用净化水进行配制，主要成分为：TN 119.2 mg ·L-1，NO3--N 107.5 mg·L-1，NH4+-N 11.7 mg·L-1，P2O555.0 mg·L-1，K2O 185.6 mg·L-1，Mg 27.5 mg ·L-1，Ca 105.4 mg·L-1，Fe 1.4 mg·L-1，EC 值1.17 dS·m-1。

图1 管道式水培系统

1.2 试验设计

将臭氧发生器前端的曝气头置入营养液储蓄桶中，产生臭氧对循环营养液进行消毒。设置3 个消毒频次处理：T1，每1 d 通1 次；T2，每3 d 通1 次；T3，每7 d 通1 次；从定植日开始，至采收结束，每次通臭氧的时长为10 min。以不通臭氧为对照（CK），采用完全随机排列，3 次重复，每重复50株。植株生长期间，调查各处理由高温引起的细菌性病害（本试验中主要是软腐病）发生情况；定植后30 d 采收、取样，进行各项指标的测定。

1.3 项目测定

1.3.1 快菜软腐病发病情况 定植后，采用计数法每5 d 统计1 次植株发病情况，计算发病率；至快菜采收（定植后30 d）共统计了6 次。

1.3.2 营养液中细菌含量 使用灭菌的容量瓶分别从各处理营养液储蓄桶中相同位置取10 mL 营养液，在无菌操作台上稀释至1 × 108倍，使用接种环在肉汁冻培养基（NA）上采用涂布的方式培养24 h，采用平板计数法进行计数，计算营养液中的细菌含量。

1.3.3 营养液中微生物种类 使用灭菌的容量瓶分别从各处理营养液储蓄桶中相同位置取500 mL 营养液，将0.22 μm 醋酸纤维微孔滤膜固定在抽滤瓶中，并连接真空抽滤泵，对营养液进行真空抽滤；然后用镊子将滤有微生物的滤膜取出，放入冻存管中，液氮处理后保存于-80 ℃冰箱，之后送至上海欧易生物医学科技有限公司进行16S 生物多样性分析。

循环营养液中的微生物环境是非常复杂的，通过高通量测序技术对序列可变区域进行检测与对比，分析不同频次臭氧消毒后循环营养液中纵向微生物群落结构的变化（董志龙，2020）。使 用QIIME 2 软 件（Bolyen et al.，2019）中 的DADA2 经过降噪，去除嵌合体后，对序列进行去重，得到的ASVs（amplicon sequence variant，扩增子序列变异）代表序列，然后进行分类学分析。

1.3.4 快菜农艺性状及生理指标 每处理随机选取3 株长势均匀的植株，记录单株叶片数；使用直尺测量叶长（L）和叶宽（W），运用椭圆面积公式（S=π ×L×W）估算叶面积；分别称量地上部和根部鲜质量，然后105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒重，分别称量地上部和根部干质量；采用乙醇浸提比色法测定叶片光合色素含量，采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定VC 含量，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量（王学奎，2006）。

1.4 数据处理

利用SPSS 20.0 软件对试验数据进行单因素分析，差异性则通过Duncan 法分析比较及LSD（P＜0.05）判断。采用Microsoft Excel 2010 软件统计分析试验数据及作图。

2 结果与分析

2.1 营养液不同臭氧消毒频次对快菜软腐病发病率的影响

由图2 可知，未进行臭氧消毒的对照快菜软腐病发病率采收期达到70%，而通入臭氧消毒后发病率显著降低，并随着消毒频次的增加发病率逐渐降低，T3（每7 d 通1 次）处理的采收期发病率仅为6%，T2（每3 d 通1 次）和T1（每1 d 通1次）处理整个生长期均未发病。表明，在循环营养液中通入臭氧消毒可有效控制快菜细菌性软腐病的发生。

图2 营养液不同臭氧消毒频次对快菜软腐病发病率的影响

2.2 不同臭氧消毒频次对营养液中细菌含量的影响

由图3 可知，3 个频次臭氧消毒处理的营养液中细菌含量均显著低于对照；同时，随着臭氧消毒频次的增加，营养液中细菌含量亦显著降低。

图3 不同臭氧消毒频次对营养液中细菌含量的影响

2.3 不同臭氧消毒频次对营养液中微生物群落多样性的影响

由ASVs 分布花瓣图可以看出（图4），通入臭氧会对快菜营养液中微生物种类产生明显影响，微生物种类比对照降低了约50%，但3 个频次臭氧处理的快菜营养液中微生物种类差异不大，ASVs数量CK ＞ T1 ≈ T2 ≈ T3，其中共同含有105 条ASVs。说明通入臭氧对快菜营养液的微生物环境有一定的抑制作用，但通入臭氧的频次对快菜营养液的微生物环境并无较大影响。

图4 不同臭氧消毒频次处理的营养液中微生物种类ASVs 分布

2.4 营养液不同臭氧消毒频次对快菜生长指标的影响

由表1 可知，T2（每3 d 通1 次）处理的快菜各生长指标均最高，地上部鲜质量和干质量显著高于对照，比对照分别提高了2.71%与0.97%；根鲜质量和干质量、叶片数、叶面积各处理间无显著差异。

表1 营养液不同臭氧消毒频次对快菜生长指标的影响

2.5 营养液不同臭氧消毒频次对快菜叶片光合色素含量的影响

由表2 可知，不同频次臭氧处理对快菜叶片光合色素含量无显著影响，其中T2（每3 d 通1次）处理的叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素含量均为最高，比对照分别增加了24.69%、16.73%、22.52%、38.62%。

表2 营养液不同臭氧消毒频次对快菜叶片光合色素含量的影响

2.6 营养液不同臭氧消毒频次对快菜品质的影响

由表3 可知，不同频次臭氧处理的快菜VC 含量均低于对照，其中T2（每3 d 通1 次）处理的VC 含量与对照差异不显著；3 个频次臭氧处理的可溶性糖含量均显著高于对照，T2 处理的可溶性蛋白含量也显著高于对照。

表3 营养液不同臭氧消毒频次对快菜品质的影响

3 讨论与结论

由于北京市农林科学院蔬菜研究所快菜种植区的管道式水培系统中营养液为循环使用，且栽培系统不易清理，日光温室内的温度又非常适合细菌生长，营养液储蓄桶中的微生物环境无法得到有效控制，病原菌进入循环系统后迅速繁衍，当快菜长至壮苗期时，叶柄底端与管道式水培架上的栽培孔产生摩擦形成伤口，循环营养液中的病原菌由伤口处进入快菜植株，从而导致快菜细菌性病害的发生。本试验结果表明，在高温夏季对水培快菜循环营养液进行臭氧消毒处理，随着通入臭氧频次的增加，营养液中细菌含量显著降低，快菜植株的软腐病发病率也逐渐降低，T2（每3 d 通1 次）和T1（每1 d 通1 次）处理整个生长期均未发病；3 个频次臭氧处理的营养液中微生物种类均较对照降低了约50%。表明使用臭氧对循环营养液进行消毒杀菌，可以通过控制潜在发病菌的种类和数量来控制高温引起的快菜细菌性病害的发生。需要注意的是，通入臭氧的浓度过高可能会对快菜植株造成消极影响，从而出现高浓度臭氧水处理的植株生长量低于较低浓度臭氧水处理的现象（张涵 等，2021）；此外，通入臭氧的位置不宜距离植株过近，否则容易对植株叶片造成伤害，短时间内表现为叶绿素的破坏（韩伟 等，2019）。

本试验中，在对水培快菜循环营养液达到杀菌目的的同时，向营养液中通入臭氧也对快菜植株生长和品质改善有促进作用。综合植株生理指标及节能考虑，T2（每3 d 通1 次，每次10 min）处理为最优处理方式，快菜植株地上部鲜质量和干质量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均显著高于对照，根鲜质量和干质量、叶片数、叶面积、叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、叶绿素a+b 含量、叶绿素a/b、类胡萝卜素含量也高于对照；但对VC 的累积表现消极影响。

在本试验条件下，采用对循环营养液通入臭氧的方式进行杀菌，用于防治快菜细菌性软腐病具有可行性。但后续研究及应用仍存在以下问题：一方面，臭氧水虽然可以迅速杀灭病原微生物，但不具有选择性，有益微生物与病原微生物都可能被杀灭，因此有必要对造成夏季高温关联腐生病害的致病菌进一步进行分离、鉴定，系统研究特定致病菌的发病机理；另一方面，臭氧在水中溶解率低，难以稳定溶解于营养液中从而会外溢至周围空气中，空气臭氧浓度积累过多可能会对人和植物造成潜在伤害。