痰涂片荧光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的应用

王艳平，郑 鹏，田 敏，石雪艳，王静波

航天中心医院血液科，北京 100049

近年来，中国老龄化问题日益突出，随着各类抗菌药物、免疫抑制剂、激素及抗肿瘤药物的广泛应用，老年患者呼吸道真菌感染的发病率上升，已成为临床值得重视的问题，因此，快速检测出病原菌，为临床及时提供治疗依据尤为重要。目前，实验室检测真菌的方法主要有直接镜检法、血清学实验、培养法、组织病理学检查等。真菌培养法一直被视为诊断真菌感染的“金标准”，但真菌培养法所需时间长，临床医生不能及时获取患者真菌感染的依据。近来又出现了真菌免疫荧光技术，又称为痰涂片荧光染色法，此方法简便快速，但在临床实验室并未推广，尤其是在呼吸道真菌感染中的应用甚少[1]。本研究通过对疑似呼吸道真菌感染的老年患者的痰涂片革兰染色法、痰涂片荧光染色法与真菌培养法检测结果进行比较，探讨痰涂片荧光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的应用价值，为临床快速、准确地获得真菌检测结果提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2021年1-12月拟诊为肺部真菌感染的479例老年患者为研究对象，其中男298例，女181例；年龄65～103岁，平均(81.5±9.4)岁。

1.2方法

1.2.1痰液标本留取 患者清洁口腔后采集清晨深咳痰于无菌痰盒内，2 h内送检。

1.2.2痰液标本合格标准 痰液直接镜检，要求白细胞计数在每个低倍视野中≥25个，上皮细胞在每个低倍视野中≤10个，不合格标本重新采集并送检。

1.2.3痰涂片革兰染色法 混匀痰液标本，涂片，干燥后火焰固定，采用革兰染液染色后镜检，看到形态典型的蓝黑色孢子、菌丝或假菌丝记录为阳性。

1.2.4痰涂片荧光染色法 混匀痰液标本，涂片，自然干燥后加一滴荧光染色液(诺立清，免疫显色试剂)，加盖玻片，轻轻按压，用滤纸把多余的染色液吸净，染色时间1～2 min，使用荧光显微镜(型号DM500)观察结果，看到荧光标记的孢子或菌丝即判断为阳性。

1.2.5真菌培养法 采用常规方法将混匀的痰液标本接种在沙保罗培养基上，35 ℃培养1周，菌株的初次分离采用科玛嘉显色培养基和YST酵母菌鉴定卡进行常规鉴定，所有菌株采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪复核鉴定，结果不一致的菌株采用核糖体DNA内转录间隔区序列分析的方法进行菌种鉴定。标准质控菌株为念珠菌ATCC8735。

1.3观察指标 比较痰涂片革兰染色法、 痰涂片荧光染色法和真菌培养法检测结果及镜下形态，并以真菌培养法为参考标准，比较痰涂片革兰染色法、痰涂片荧光染色法两种方法的灵敏度、特异度、总符合率、阳性预测值及阴性预测值。灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(假阳性例数+真阴性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(假阴性例数+真阴性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；符合率=(真阴性例数+真阳性例数)/总例数×100%。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种方法的真菌检测结果比较 痰涂片革兰染色法、 痰涂片荧光染色法和真菌培养法检出率分别为13.6%、36.5%和34.2%，差异有统计学意义(χ2=75.828，P<0.001)；痰涂片荧光染色法真菌检出率略高于真菌培养法，但差异无统计学意义(χ2=0.552，P=0.457)； 痰涂片荧光染色法真菌检出率高于痰涂片革兰染色法，差异有统计学意义(χ2=67.269，P<0.001)。痰涂片革兰染色法真菌检出率低于真菌培养法，差异有统计学意义(χ2=56.244，P<0.001)。见表1。

表1 3种方法的真菌检测结果比较(n=479)

2.2痰涂片荧光染色法与痰涂片革兰染色法对真菌感染的诊断效能比较 以真菌培养法为金标准，痰涂片荧光染色法、痰涂片革兰染色法分别与真菌培养法结果比较见表2、3。痰涂片荧光染色法的灵敏度明显高于痰涂片革兰染色法,而特异度却略低于痰涂片革兰染色法，差异有统计学意义(P<0.05)；痰涂片荧光染色法的约登指数、总符合率、阳性预测值和阴性预测值明显高于痰涂片革兰染色法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表2 痰涂片荧光染色法与真菌培养法结果比较(n)

表3 痰涂片革兰染色法与真菌培养法结果比较(n)

表4 痰涂片荧光染色法与痰涂片革兰染色法诊断效能比较

2.3真菌培养结果 479例患者的痰液标本真菌培养共检出164株真菌，分别是白色念珠菌107株(65.2%)，光滑念珠菌19株(11.6%)，热带念珠菌15株(9.1%)，曲霉菌11株(6.7%)，耳念珠菌5株(3.0%)，葡萄牙念珠菌3株(1.8%)，克柔念珠菌、特纳里夫念珠菌、星状丝孢酵母、毛霉各1株，共4株(2.4%)。

2.4痰涂片革兰染色法和痰涂片荧光染色法镜下形态 痰涂片革兰染色背景呈紫红色或粉红色，菌丝孢子被染成蓝黑色，低倍镜(×10)下背景杂乱，孢子菌丝形态与痰液标本中脂滴、细胞碎片、植物纤维杂质的形态不好区分(图a1)，疑似的菌丝孢子形态需在油镜下确认，油镜下可见菌丝孢子形态(图a2)。痰涂片荧光染色法中的菌丝孢子在荧光显微镜下发出明亮的蓝色荧光，背景黑色，真菌形态清晰可见(图b1～b4)，低倍镜(×10)下即可大致确认阴、阳性，特异性非常强(图b1、b3),高倍镜(×40)下观察菌丝孢子形态(图b2、b4)，根据孢子和菌丝的形态、大小和排列等特征可初步判断真菌种属，例如念珠菌具有酵母样孢子和藕节样假菌丝(图b2)；曲霉菌有有隔菌丝，约45度角分枝，呈鹿角样(图b4)。

注：a1、a2为革兰染色菌丝孢子；b1～b4为荧光染色菌丝孢子；b1、b2为念珠菌；b3、b4为曲霉菌；a1、b1、b3为低倍镜(×10),b2、b4为高倍镜(×40),a2为油镜(×100)。

3 讨 论

老年患者常伴有严重的基础疾病、免疫力低下，长期使用抗菌药物、激素及免疫抑制剂导致身体免疫功能低下，菌群失调，容易继发真菌感染，感染部位以呼吸道占首位。患者只要存在易感因素都应进行真菌的反复检测，如有真菌感染史应定期跟踪监测，以便及时诊断和治疗。由于病原学检查可以为临床诊治提供有力依据，建议将真菌检测列为常规项目[2]。本研究中痰液标本真菌检出率为34.2%(真菌培养法)，表明真菌感染率较高，早期快速、准确检出真菌是治疗的关键。应用痰涂片革兰染色法、痰涂片荧光染色法分别对479份痰涂片检测真菌，并以真菌培养法为标准，对检测结果进行比较，结果显示痰涂片荧光染色法真菌检出率略高于真菌培养法，但差异无统计学意义(P=0.457)。痰涂片革兰染色法真菌检出率明显低于真菌培养法和痰涂片荧光染色法，差异有统计学意义(P<0.001)。以上结果表明痰涂片荧光染色法较痰涂片革兰染色法的检出率更高，可以减少漏诊，痰涂片荧光染色法检出率与真菌培养法接近，有利于患者及早诊断和治疗。

以往痰涂片革兰染色法以其操作简单、观察方便等优点被广泛应用于实验室，但其检出率明显低于真菌培养法[3]，痰涂片革兰染色法常规用于痰培养前的镜检，一方面，痰涂片保证了痰液标本的质量，能提高痰培养的阳性率；另一方面，合格痰液标本的细菌革兰染色涂片信息可预测培养结果[4]，本研究同样也验证了上述观点，痰涂片革兰染色法检出率明显低于真菌培养法，但有助于选定合格的标本。痰涂片革兰染色法真菌检出率非常低，笔者总结主要有以下几方面原因：(1)痰涂片太厚，真菌孢子菌丝混杂在标本内部，染色不明显，无法辨认；(2)实验室所用染色仪器的影响，导致染色太浅或太深均不利于镜下观察；(3)低倍镜下孢子菌丝的形态不明显，易与植物纤维、细胞碎片混淆，油镜观察很难做到整片浏览；(4)检测人员镜下观察能力不足。

近些年来，痰涂片荧光染色法逐步在国内被推广，因其具有较高的灵敏度和特异度，越来越受到临床实验室的青睐。痰涂片荧光染色法所使用的免疫显色试剂主要功能成分包括β-D-葡聚糖结合蛋白和荧光素，能特异性地结合真菌细胞壁β-D-葡聚糖和几丁质多糖，使真菌细胞壁被双重标记，在荧光显微镜紫外光(波长340～380 nm) 或者蓝紫光(波长420～490 nm)特定的激发光波段下，菌丝或者孢子发出明亮的蓝色荧光，在黑色背景下结构清晰、易于分辨，提高真菌的检出率，而且实验过程非常简单，只需滴加一滴试剂，等待1～2 min即可镜检。查阅文献发现，国内学者大多将痰涂片荧光染色法用于浅部真菌的检测，标本类型主要为皮屑、甲屑、毛发、皮肤病理组织等，研究结果均显示痰涂片荧光染色法是一种灵敏度高、快捷、可靠的真菌检测方法，阳性检出率高于常规镜检法[5-11]。刘鸿宇等[12]提出，痰涂片荧光染色法与痰涂片革兰染色法相比，具有更高的灵敏度、特异度和准确度，可减少假阴性发生，降低对真菌的漏检率，值得临床推广应用。本研究采用3种不同的真菌检测方法检测老年患者痰液标本，研究结果与上述文献一致。痰涂片荧光染色法虽然过程简便、快捷，具有较高的灵敏度和特异度，但荧光染色后除了真菌外，细支气管上的弹性纤维、外源性植物纤维、脂肪滴、寄生虫也可以发出亮蓝色的荧光，需结合形态区分[13]。在荧光镜检实际工作中，笔者总结出一些需要注意的地方，如痰液标本一定要混匀，挑取黏性或含血丝部位，均匀涂抹在玻片上，切勿蘸取唾液或涂得太厚，以免造成假阴性结果；压片后一定要用滤纸按压盖玻片吸去多余的染色剂，这样避免痰液标本悬浮流动，可使镜下观察更清晰，同时也可避免液体溢出造成污染；染色后尽快读片，以免试剂干涸荧光淬灭影响观察；玻片上会有少量纤维杂质，同样也会发出荧光，但没有典型的横隔和出芽结构，形态一般不规则，大小亮度与真菌有很大差异，一定要注意区分，避免出现假阳性结果；试剂常温保存，避免高、低温环境及阳光直射影响试剂效果。

痰涂片荧光染色法的特异度和灵敏度均较高，不乏导致定植真菌的检出，因此可能导致检出率高于真菌培养法。在临床工作中，老年住院患者的念珠菌病发病率较高，这明显与口腔真菌的高定植率有关，中老年住院患者口腔真菌定植检出率最高的是白色念珠菌，占95．5%[14]。伍海英[15]在1 020份呼吸道标本中共检测出真菌271株，主要为白色念珠菌，占检测出的病原菌总株数的76．0%，与本院培养法检出的白色念珠菌的比例65.3%接近。本研究中的研究对象均为65岁以上的老年人，主要症状以咳嗽、咳痰为主，基础疾病较多，大部分长期使用抗菌药物治疗，很容易发生菌群失调，导致机体免疫功能低下，念珠菌可在局部大量生长繁殖，由酵母相转为菌丝相，毒力增强，导致感染，甚至导致播散性念珠菌病，因此，定植性的真菌检出也很重要，应根据临床病情，结合其他检测结果综合诊断。

综上所述，通过3种真菌检测方法结果的比较，发现痰涂片荧光染色法能够快速、准确地判断真菌，提高了真菌检出率，在老年患者呼吸道真菌感染的诊断中具有重要的价值，有利于患者及早诊断和治疗，值得实验室推广应用。