血清miR-4463和miR-1293表达水平预测结肠癌术后预后不良的临床价值
2023-03-01陈鑫源
张 啸,李 涛,郑 植,陈鑫源,陆 江
1.上海市第一人民医院嘉定分院普外科,上海 201803;2.江苏省人民医院溧阳分院普外科,江苏常州 213300
结肠癌是外科的常见恶性肿瘤,位居城市居民肿瘤发病率的第2位,病死率的第4位。结肠癌的早期常常无特异性症状,多数患者在确诊时均已经处于中晚期,术后5年生存率仍较低[1]。全球每年新发结肠癌患者在120万例以上,而约有60万例患者死于结肠癌[2]。我国结肠癌的发病率逐年升高,目前临床上仍缺乏对结肠癌诊断和预后判断的敏感指标[3],因此,探索灵敏度较高的结肠癌诊断和预后判断指标具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是单链非编码RNA,与靶基因具有结合位点,对靶基因具有调控作用,参与肿瘤细胞的增殖和迁移等生物学功能[4]。本研究通过检测结肠癌患者血清miR-4463和miR-1293表达水平,分析二者在结肠癌预后判断中的价值。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择2019年1月至2021年12月上海市第一人民医院嘉定分院(25例)和江苏省人民医院溧阳分院(90例)收治的115例结肠癌手术患者纳入结肠癌组,其中男65例,女50例;年龄35~79岁,平均(53.85±15.12)岁;有饮酒史21例,无饮酒史94例;有吸烟史27例,无吸烟史88例;体质量指数(BMI)为(23.79±3.28)kg/m2。选择同期65例在上海市第一人民医院嘉定分院(5例)和江苏省人民医院溧阳分院(60例)进行结肠良性疾病手术治疗患者纳入良性疾病组,其中男34例,女31例;年龄31~77岁,平均(52.94±11.00)岁;有饮酒史3例,无饮酒史34例;有吸烟史26例,无吸烟史39例;BMI为(22.48±4.10)kg/m2。纳入标准:所有患者均进行病理学检查确诊,结肠良性疾病均为结肠腺瘤;结肠癌患者均为首次发病,术前没有接受过放化疗。排除标准:合并其他部位恶性肿瘤;患者有手术禁忌证或者不愿意接受手术;合并血液性和免疫性疾病;结直肠有急慢性感染;存在心、肝、肾等重要脏器功能不全;合并高血压、糖尿病、冠心病等慢性疾病;存在智力障碍或者精神疾病。选择同期30例在上海市第一人民医院嘉定分院进行健康体检的健康者纳入健康对照组,其中男17例,女13例;年龄36~80岁,平均(53.07±11.92)岁;有饮酒史14例,无饮酒史16例;有吸烟史17例,无吸烟史13例;BMI为(23.63±3.38) kg/m2。3组研究对象年龄、性别、BMI等基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书,并经两家医院医学伦理委员会审核通过。
1.2方法
1.2.1癌胚抗原(CEA)检测 结肠癌和结肠良性疾病患者入院时,结肠癌患者术后7 d,健康对照组在门诊体检时均抽取清晨空腹静脉血约5 mL,在室温下静置30 min后,用离心机分离上层血清放置在-80 ℃的冰箱中待测。采用全自动化学发光仪(Cobas e601型,罗氏公司,化学发光微粒子免疫检测法)对CEA进行检测,试剂盒为博奥生物有限公司产品。
1.2.2反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 结肠癌和结肠良性疾病患者入院时,结肠癌患者术后7 d,健康对照组在门诊体检时均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周静脉血3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待检。采用Trizol试剂(碧云天生物技术有限公司)提取血清总RNA,使用反转录试剂盒(美国Sigma公司)将总RNA反转录为cDNA,并放置在-20 ℃的冰箱中保存。然后采用荧光染料法以cDNA为模板在IQ5 RT-PCR上进行扩增。采用Primer express 3.0软件设计合成引物探针,由上海英骏生物技术有限公司合成。miR-4463的正向引物为5′-GGCCCACCCCAGTCTC-3′;反向引物为5′-GCAGGAGACTGGGGTG-3′。miR-1293的正向引物为5′-CCTGCCGGGGCTAAAGTGCTG-3′;反向引物为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。U6的正向引物为5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAA TTGGAA-3′;反向引物为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。采用PCR仪[美谷分子仪器(上海)有限公司,ABI 7900型]进行检测,采用20 μL PCR扩增反应体系,其组成为引物1 μL,cDNA 1 μL,TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL,加入双蒸馏水补充至20 μL。通过如下循环:预变性5 min,预变性温度调节为95 ℃,之后在95 ℃条件下变性15 s,然后在60 ℃的条件下进行退火,时间为30 s,之后在72 ℃条件下延长1 min,总共40个循环,最终采用循环阈值法定量分析miR-4463和miR-1293的表达水平,以U6为内参,以2-ΔΔCt计算miR-4463、miR-1293相对表达量。
1.3观察指标 观察各组血清miR-4463、miR-1293和CEA表达水平的变化,对结肠癌患者发生预后不良的相关影响因素进行单因素和多因素分析,分析血清miR-4463、miR-1293和CEA表达水平在预测结肠癌术后预后不良中的效能。
2 结 果
2.1各组3项指标表达水平比较 结肠癌组入院时miR-4463和CEA表达水平明显高于良性疾病组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);良性疾病组的miR-4463表达水平高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。良性疾病组的CEA水平与健康对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结肠癌组术后7 d血清miR-4463和CEA表达水平分别为1.75±0.56、(1.76±0.54)ng/mL,二者均较入院时明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌组入院时miR-1293表达水平明显低于良性疾病组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);良性疾病组miR-1293表达水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌组术后7 d血清miR-1293表达水平为4.52±1.18,较入院时明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2结肠癌术后预后不良的单因素分析 所有结肠癌患者均随访3~36个月,平均(22.24±4.06)月,其中25例出现死亡,纳入预后不良组,90例至随访结束时仍生存纳入预后良好组。预后不良组与预后良好组性别、年龄和肿瘤部位构成比比较,差异无统计学意义(P>0.05);而两组肿瘤最大径、肿瘤分化程度、肿瘤分期构成比及miR-4463、miR-1293、CEA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3结肠癌术后预后不良的多因素分析 将2.2中单因素分析差异有统计学意义的指标(肿瘤最大径、肿瘤分化程度、肿瘤分期及miR-4463、miR-1293、CEA表达水平)作为自变量,将是否发生预后不良作为因变量,进行二元Logistic回归分析,发现肿瘤分期为Ⅲ期,miR-4463和CEA表达水平升高,以及miR-1293表达水平降低均是结肠癌术后预后不良的独立危险因素(P<0.05)。见表3。
表1 各组3项指标表达水平的比较
2.43项指标检测预测结肠癌术后预后不良的效能 血清miR-4463和miR-1293表达水平预测结肠癌术后预后不良的曲线下面积(AUC)明显大于CEA(P<0.05)。根据是否发生预后不良拟合二元Logistic回归方程Y=1.35XmiR-4463-2.45XmiR-1293-1.92,得到联合检测指标,联合检测预测结肠癌术后预后不良的灵敏度为96.0%,特异度为78.9%,AUC为0.930,AUC明显大于miR-4463(Z=2.221,P<0.05)和miR-1293(Z=2.680,P<0.05)单独检测,而两项指标单独检测的AUC比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图1。
2.5结肠癌患者血清miR-4463和miR-1293表达水平的相关性分析 结肠癌患者血清miR-4463表达水平与miR-1293表达水平呈负相关(r=-0.728,P<0.05)。
表2 结肠癌术后预后不良的单因素分析 (n或
表3 结肠癌术后预后不良的多因素分析
表4 血清miR-4463、miR-1293和CEA检测预测结肠癌术后预后不良的效能
图1 不同指标预测结肠癌术后预后不良的ROC曲线
3 讨 论
虽然结肠癌的治疗方法不断改进,但术后仍有不少患者出现转移和复发,严重影响结肠癌患者的预后[5]。随着对结肠癌分子机制研究的深入,研究者发现靶向药物能够在一定程度上改善患者的预后[6]。肿瘤分期高、分化程度低和有淋巴结转移是结肠癌患者预后不良的危险因素,但结肠癌具有明显的异质性,即使相同肿瘤分期的患者对同样治疗方案的敏感性也不一样,部分患者甚至存在治疗抵抗[7-8]。因此,寻找预测结肠癌预后的指标对于进一步优化结肠癌治疗方案具有重要的临床价值。本研究结果显示,预后不良组与预后良好组性别、年龄和肿瘤部位构成比比较,差异无统计学意义(P>0.05);而两组肿瘤最大径、肿瘤分化程度、肿瘤分期构成比及miR-4463、miR-1293和CEA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步进行多因素分析,结果显示肿瘤分期为Ⅲ期,miR-4463和CEA表达水平升高,以及miR-1293表达水平降低均是结肠癌术后预后不良的独立危险因素(P<0.05)。同时进行ROC曲线分析发现,血清miR-4463和miR-1293在预测结肠癌术后预后不良中的效能明显优于CEA。
本研究结果显示,结肠癌组入院时血清miR-4463表达水平明显高于良性疾病组和健康对照组,并且结肠癌组术后 7 d血清miR-4463表达水平较入院时明显降低,说明miR-4463参与了结肠癌疾病的发生、发展。miR-4463是新发现的miRNA,现已知其与细胞增殖和侵袭关系密切,最早发现其主要在血管闭塞性疾病中能够抑制低密度脂蛋白诱导平滑肌的迁移,机制可能为通过靶向调控下游人血管肌的基因,从而达到对血管平滑肌的调控[9-10]。而miR-4463在癌症中的研究仍比较少,一项关于肝癌的研究发现,在甲胎蛋白水平没有升高前,肝癌患者血清中miR-4463表达水平已出现明显升高,并且高表达miR-4463患者术后生存期明显缩短,认为miR-4463是肝癌预后不良的潜在指标[11]。有淋巴结转移的结肠癌组织中miR-4463表达水平明显高于无淋巴结转移的结肠癌组织,在结肠癌细胞体外研究中发现miR-4463具有促进结肠癌细胞增殖、迁移和抑制细胞凋亡的作用,并认为miR-4463可能成为预测结肠癌预后的潜在指标[12]。本研究结果显示,血清miR-4463表达水平升高是结肠癌术后预后不良的独立危险因素,对于miR-4463表达水平升高的患者是否需要采取进一步治疗措施仍需深入研究明确。本研究结果显示,当血清miR-4463为4.17时,其预测预后不良的灵敏度为72.0%,特异度为87.8%,AUC为0.856,说明血清miR-4463检测预测结肠癌术后预后不良具有较高的效能。
本研究结果显示,结肠癌组入院时血清miR-1293表达水平明显低于良性疾病组和健康对照组,并且发现结肠癌组术后7 d血清miR-1293表达水平较入院时明显升高,说明miR-1293参与了结肠癌的发生、发展,miR-1293基因是结肠癌的抑癌基因。miR-1293基因位于12q1312染色体上,目前,对miR-1293基因在癌症中的生物学行为研究结论存在争议。在肺癌的研究中发现,肺癌组血清miR-1293表达水平明显高于对照组,并且与淋巴结转移、肿瘤分期和肿瘤浸润程度关系密切,血清miR-1293表达水平与肺腺癌患者的生存期明显相关,在肺腺癌中miR-1293基因表现为促癌基因[13-14];而在三阴乳腺癌中,miR-1293则起到抑癌基因的作用,可抑制乳腺癌的增殖和迁移[15],说明miR-1293基因的功能具有一定的组织依赖性。本研究结果还显示,血清miR-1293表达水平升高是结肠癌术后预后不良的独立保护因素,并且发现当血清miR-1293为1.86时,其预测预后不良的灵敏度为84.0%,特异度为73.3%,AUC为0.826,说明血清miR-1293检测在预测结肠癌术后预后不良中具有较高的效能。本研究发现,血清miR-1293和miR-4463检测联合预测结肠癌术后预后不良的灵敏度为96.0%,特异度为78.9%,AUC为0.930,其AUC明显大于miR-1293和miR-4463单独检测,说明二者在预测结肠癌术后预后不良中具有一定互补性,确切的机制需要进一步研究。本研究还发现血清miR-1293表达水平与miR-4463表达水平呈负相关,说明miR-1293基因在结肠癌中表现为抑癌基因,而miR-4463基因在结肠癌中表现为促癌基因,在人体中二者存在某种平衡,若该平衡出现紊乱会导致肿瘤的发生,其具体机制需要进一步研究。
综上所述,miR-4463和miR-1293参与了结肠癌的发生、发展,血清miR-4463和miR-1293是结肠癌术后预后的独立影响因素,在预测不良预后中具有较高的效能。