血清基质金属蛋白酶-13联合血小板因子-4与miR-29检测在多发性骨髓瘤中的临床价值*
2023-03-01孔繁林吴建伟侯学伶刘振腾米盼盼樊国峰
孔繁林,吴建伟,侯学伶,路 博,刘振腾,米盼盼,朱 军,樊国峰△
河北中石油中心医院:1.骨科;2.检验科,河北廊坊 065000
多发性骨髓瘤(MM)为恶性浆细胞病,其肿瘤的细胞来自于骨髓中内的浆细胞。MM的特点是骨髓浆细胞发生异常增生并伴随着轻链或单克隆的免疫球蛋白过量的产生。然而,因早期MM患者的症状并不典型,而肾病、风湿或淋巴瘤等疾病又可造成反应性浆细胞的增加,干扰了临床诊断[1-2];其次,目前诊断MM主要依靠骨髓细胞学相关的检查,但病灶呈局灶性分布,单部位骨髓穿刺常常不能明确诊断,另外,骨髓穿刺操作的有创性导致部分患者并不太愿意接受检查而错过了早期的临床诊断。因此,临床上急需找寻一类特异度、灵敏度更高的诊断标志物,以提高MM患者的诊疗质量。基质金属蛋白酶-13(MMP-13)是将细胞外基质水解的一类蛋白水解酶,用于调节肿瘤细胞的生长及转移过程。血小板第4因子(PF4)是由血小板α颗粒合成的一种特异性蛋白质。近年发现,PF4通过抑制人血管内皮祖细胞的生长和迁移,进而在MM发病过程中起到抑制血管新生作用,对MM起抑制作用[3]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22核苷酸的非编码RNA,通过调控表观遗传参与人体的各类生理病理,并关系到肿瘤发展及转移等。近年来研究发现miR-29与MM的发生、发展密切相关[4]。本研究旨在探讨血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鉴别诊断和疗效评估中的价值。
1 资料与方法
1.1一般资料 将2018年2月至2020年1月于本院确诊并治疗的MM患者80例纳入研究作为病例组,所有患者的诊断均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》[5]。患者治疗方法:地塞米松+硼替佐米+环磷酰胺治疗,28 d为1个治疗周期,每例患者经4个治疗周期,患者每隔1周到血液内科门诊进行随访。根据欧洲血液和骨髓移植组对患者的疗效评价[6],分为完全缓解(cCR)、接近完全缓解(nCR)、部分缓解(PR)、微小缓解(MR)、无变化(NC)、病情进展(PD)等几个等级,并根据患者治疗后的具体疗效,将疗效并未达到PR等级的患者纳入难治组(32例),疗效到达了PR或者以上的患者纳入缓解组(48例)。同期选取本院体检健康者80例作为对照组。纳入者均意识清楚,能够正常的实施语言表达,可以和调查人员实施正常的沟通交流。排除标准:(1)入院前在其他的医院实施免疫治疗或者放化疗者;(2)急慢性感染、甲状腺疾病、其他脏器肿瘤者。本研究的开展经医院伦理委员会批准。纳入研究者均自愿参加本研究。
1.2方法
1.2.1临床资料与标本的采集 由研究人员将患者的性别、年龄、体质量指数(BMI)等基本信息进行记录,BMI=体重/身高2(kg/m2)。采用促凝血管将禁食10 h以上的MM患者治疗前、4个治疗周期结束后和入院体检健康者的静脉血标本5 mL收集起来。收集的标本在1 h内于4 ℃、3 500×g离心10 min,收集上层血清,并放在-80 ℃冰箱中保存待测。
1.2.2血清MMP-13与PF4水平的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清MMP-13和PF4水平,试剂盒购自南京基蛋生物科技有限公司,严格按试剂盒内说明书中的步骤进行操作。血清MMP-13和PF4检测的批内和批间变异系数均小于5%,提示此次实验操作具有很好的精确度和重复性。
1.2.3血清miR-29表达水平的检测 血清总RNA的提取依据血液RNA提起试剂盒(购自Bioteke公司)内的说明书步骤实施。取上述方式提取的RNA,使用反转录试剂盒(购自Takara公司)将其反转录成cDNA,之后采用实时荧光定量PCR(qPCR),依据SYBR GREEN试剂盒中的说明书进行操作。反应条件:95 ℃条件下进行5 min变性;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环45次。各组均设置检测复孔3个。内参基因采用GAPDH。引物序列如下,miR-29,F:5′-AATCCTTTATGTGACCAGAA-3′,R:5′-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3′;GAPDH,F:5′-AGA AGG CTGGGGCTCATTTG-3′,R:5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。采用2-ΔΔCt法对miR-29的相对表达水平进行计算。
2 结 果
2.1两组临床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比较 病例组血清MMP-13和miR-29水平高于对照组,而病例组血清PF4水平低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 两组临床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比较或n(%)]
2.2MM患者化疗前后血清MMP-13、PF4和miR-29水平比较 与治疗前相比,治疗后患者PF4水平增高,MMP-13和miR-29水平降低(P<0.05)。治疗前,缓解组患者血清MMP-13和miR-29水平均低于难治组,缓解组患者血清PF4水平高于难治组,差异均有统计学意义(P<0.05);缓解组治疗后血清MMP-13和miR-29水平较治疗前均降低,缓解组治疗后血清PF4水平较治疗前增高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。
表2 80例MM患者化疗前后血清MMP-13、PF4、miR-29水平比较
2.3血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鉴别诊断和疗效评估的ROC分析 ROC曲线分析显示:血清miR-29区分MM患者与健康者的AUC为0.913(95%CI:0.855~0.971,P<0.001),诊断界值为12.4,灵敏度为84.1%,特异度为90.8%;血清MMP-13区分MM患者与健康者的AUC为0.802(95%CI:0.742~0.863,P<0.001),诊断界值为46.6 pg/mL,灵敏度为81.2%,特异度为62.2%。血清PF4区分MM患者与健康者的AUC为0.602(95%CI:0.542~0.663,P=0.005),诊断界值为22.6 μg/L,灵敏度为61.2%,特异度为52.2%。血清MMP-13、PF4和miR-29联合检测用于区分MM患者与健康者的AUC为0.924(95%CI:0.868~0.979,P<0.001),灵敏度为82.5%,特异度为94.6%。见图1。
注:A为MMP-13、PF4和miR-29单项用于诊断MM的ROC曲线;B为MMP-13、PF4和miR-29联合检测用于诊断MM的ROC曲线;C为MMP-13、PF4和miR-29单项用于区分缓解组与难治组的ROC曲线;D为联合检测MMP-13、PF4和miR-29用于区分缓解组与难治组的ROC曲线。
血清miR-29区分缓解组与难治组的AUC为0.874(95%CI:0.773~0.965,P<0.001),诊断界值为16.2,灵敏度为78.3%,特异度为81.7%;血清MMP-13区分缓解组与难治组的AUC为0.824(95%CI:0.781~0.866,P<0.001),诊断界值为60.6 pg/mL,灵敏度为83.8%,特异度为60.3%;血清PF4区分缓解组与难治组的AUC为0.534(95%CI:0.481~0.606,P=0.012),诊断界值为18.6 μg/L,灵敏度为63.8%,特异度为50.3%;联合检测血清MMP-13、PF4和miR-29用于区分缓解组与难治组的AUC为0.889(95%CI:0.822~0.971,P<0.001),灵敏度90.7%,特异度77.4%。见图1。
3 讨 论
JIIAN等[7]通过对淋巴瘤细胞系中MMP-13基因的检测,发现与正常淋巴细胞株相比MMP-13基因显著上调,且与肿瘤调控因子--信号转导和转录激活因子3的活性呈正相关。PF4是近年发现的重要的抑癌基因。LIANG等[8]指出,将过表达PF4基因的慢病毒转染接受异种骨髓移植的骨髓瘤小鼠后,免疫染色显示骨髓瘤细胞凋亡和血管生成受到抑制,该实验在骨髓瘤小鼠模型中证实了PF4的肿瘤生长抑制作用。miR-29是一种新型的基因调控因子,能在转录后水平抑制靶基因的表达或蛋白质翻译。KOLLINEROVA等[9]通过体外培养MM细胞株,观察到上调miR-29可显著降低MM细胞株的增殖能力与迁移能力。
本研究发现,MM患者血清MMP-13与miR-29水平均显著高于对照组(P<0.05),而PF4水平显著低于对照组(P<0.05),这一结果与前期有关MM的体内和机制研究相符合[3,8-9],提示MM患者体内MMP-13、miR-29与PF4的异常表达可能参与MM疾病进程。在评估患者治疗疗效时,本研究结果显示:治疗前,缓解组患者血清MMP-13和miR-29水平均低于难治组(P<0.05),缓解组患者血清PF4水平高于难治组(P<0.05)。出现这一结果表明血清MMP-13、miR-29与PF4这3个指标在MM病情更加凶险的患者中变化更为显著,在提示患者预后更差方面具有较高的价值。缓解组治疗后血清MMP-13和miR-29水平较治疗前均降低,缓解组治疗后血清PF4水平较治疗前增高,这一结果提示血清MMP-13、miR-29与PF4水平在MM患者接受治疗并取得良好疗效时会有所好转,提示患者预后较好。值得注意的是,难治组患者治疗前与治疗后血清MMP-13、PF4和miR-29水平的差异均无统计学意义(P>0.05),出现这一结果的原因可能为难治组MM患者在经过4个周期化疗后病情并为得到有效控制,这一结果也进一步提示血清MMP-13、PF4和miR-29在辅助评估患者疗效中具有一定价值。ROC曲线分析显示:血清MMP-13、PF4和miR-29联合检测用于区分MM患者及其疗效的灵敏度、特异度均高于单项诊断,提示三者联合诊断MM及用于疗效评估的效果较好。然而,本研究仍存在下面的不足:(1)本研究所纳入的患者全部为本院患者,这可能会使研究结果产生某些偏倚,今后需采用多中心的队列研究进一步分析结果;(2)本研究纳入80例MM患者,纳入的病例数并不多,后期需要扩大样本量来进一步证实血清MMP-13、PF4和miR-29检测对MM患者的临床价值。
综上所述,血清MMP-13、PF4和miR-29对MM诊断及疗效评估具有潜在的价值,有望为MM的诊疗提供新的途径与思路。