翻埋与覆盖林木枝条对干旱区沙化土壤及紫花苜蓿根系丛枝菌根真菌的影响

王博，张茹，刘静，李志刚*

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏草牧业工程技术研究中心，宁夏 银川 750021；3.宁夏师范学院数学与计算机科学学院，宁夏 固原 756000）

土壤退化在全球干旱半干旱地区普遍发生，而沙化是最主要的土地退化类型之一，也是影响全球生态和社会经济最严重的问题之一［1］。据此，国内外就覆盖或者有机物料添加措施进行土壤水分保持和土壤养分提高方面展开了大量研究，常见的措施有秸秆还田覆盖［2］、砾石覆盖［3］、地表覆膜覆盖［4］、有机物料（秸秆、有机肥等）添加［5］及凋落物返还等。作为沙化地区生态环境和农田的主要保护屏障-生态防护林和农田防护林在我国北方干旱半干旱地区广泛分布［6］，因而近年来学者们在利用林木废弃物/修剪物进行沙化土壤改良方面也开展了大量研究，而且表明林木枝条翻埋或覆盖可以显著改善土壤水分条件［7］、提高土壤养分［8］、促进植物生长［9-10］，同时也改善了微生物的群落结构和功能［11］。然而，目前还缺乏林木枝条改良对土壤及植物根系丛枝菌根真菌影响的研究。

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是陆地生态系统分布最广泛的互惠共生菌之一，可以与超过80%的陆生植物根系形成共生关系［12］。AM真菌对植物生长及土壤养分循环具有重要作用，包括提高植物对水分及碳、氮、磷等养分的吸收利用，促进土壤氮、磷循环［13］，增强植物对环境压力（营养缺乏、干旱、土壤退化）的耐受性［14-16］。Aguilar等［17］研究发现，施用有机肥料会刺激菌根的形成，并增加AMF的多样性［18］。Alguacil等［19］研究还表明，土壤中添加作物秸秆亦促进了土壤中AM真菌多样性和生物活性，并且AM真菌微生物多样性及生物活性与土壤质量的改善呈正相关。因此，推测翻埋与覆盖林木枝条可能对AM真菌的侵染率和多样性的提升亦具有促进作用，同时AM真菌侵染率和多样性的提高对土壤性质的改善及植物生长的促进亦具有积极作用，然而这方面的研究报道较少。据此，在本研究团队前期试验的基础上［7-11］，本研究进一步探讨翻埋与覆盖林木枝条对干旱区沙化土壤及植物根系AM真菌侵染率及多样性的影响，同时分析AM真菌侵染率及多样性与土壤性质及植物生长间的关系，旨在为该地区沙化土壤改良及可持续利用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

研究区位于贺兰山东麓的银川腹部沙地（106°08′-107°22′E、38°28′-38°42′N），属于干旱半干旱过渡区，温带大陆性气候，降水稀少且时空分布不均，年平均气温10.1℃，极端最高气温39.6℃，极端最低气温-27.9℃。年平均降水量181.2 mm，且大部分集中于7-9月。年平均蒸散量为2139 mm。土壤质地粒径分布为92.5%砂、5.48%粉土、2.02%粘土，有机质含量为2.01 g·kg-1。土壤的pH为9.07。研究区主要植物种有猪毛蒿（Artemisia scoparia）、黑沙蒿（Artemisia ordosica）、赖草（Leymus secalinus）、虫实（Corispermum hyssopifolium）、中亚白草（Pennisetum centrasiaticum）等。天然植被类型为荒漠草原，但目前农田防护林分布面积较大。另外，紫花苜蓿（Medicago sativa）是该地区畜牧业发展需要的重要牧草，被广泛种植。

1.2 试验设计

1.2.1 样地布置 该试验于2011年完成样地布置。在研究区选择平坦且土壤条件具有代表性的地块进行试验。本研究采用随机区组试验设计，每个区组设置4个处理：1）地表覆盖粉碎长度约为1 cm的杨树（Populus alba）枝条，厚度3～4 cm（M）；2）将粉碎长度约1 cm的杨树枝条以5%的比例（质量比）翻埋至0～20 cm深的土层中（W）；3）在（2）处理的基础上覆盖长度为1 m左右的杨树枝条，厚度为30 cm，覆盖地表面积约60%（WB）；4）以不做任何添加为对照（CK）。以上每个处理重复5次（5个区组），总计20个试验小区，每个试验小区面积为3 m×3 m。以上M和W的处理方式虽然不同，但是添加量均相同，换算为总氮和总磷添加量，则均相当于添加外源氮和磷分别为0.156 g·kg-1和0.019 g·kg-1。

在本试验期间，2011-2014年未种植紫花苜蓿，旨在观测无植物种植下土壤性质变化；2015年种植紫花苜蓿，苜蓿以15 cm行距进行条播，播量为1.11 g·m-2，播前覆盖处理移去覆盖物，待苜蓿幼苗长至10 cm左右将覆盖物复原。播前每个小区土壤施尿素21 g·m-2、磷酸二氢铵11 g·m-2。本研究在试验处理后的第8年进行取样测定AM真菌相关指标及土壤相关指标。

1.2.2 土壤及紫花苜蓿根系取样 每个小区用灭菌的土钻采用“S”形取样法进行3次重复土壤采样，采集深度为0～20 cm，混匀后剔除其中杂质，过2 mm筛，均匀分成3部分，一部分装入无菌塑封袋且暂存于冷藏箱中用于土壤酶活性的测定；另一部分装入标记好的灭菌离心管中用于丛枝菌根真菌测序；其余土样带回实验室风干用于土壤理化性质的测定。同时，利用铁锹按照破坏性取样的方法采集0～20 cm苜蓿根样，每个小区苜蓿根样采集位置同土壤采集位置。将采集的根系剪下毛根并冲洗干净，一部分装入无菌离心管中，送样进行丛枝菌根真菌测序，另一部分保存在FAA固定液中，用于菌根侵染状况的测定。

1.2.3 测定指标及方法 2019年8月收获试验小区当年紫花苜蓿地上部分，在85℃下烘干记为地上生物量。土壤水分采用烘干法测定（105℃烘24 h）。土壤pH、有机碳、全氮、全磷、无机氮、速效磷的测定均参考鲍士旦［20］《土壤农化分析》中的相关方法，脲酶活性、碱性磷酸酶活性、蔗糖酶活性和过氧化氢酶活性的测定方法参考关松荫［21《］土壤酶及其研究法》，菌根侵染率采用醋酸墨水染色-网格交叉法测定［22］，土壤孢子数采用湿筛倾析-蔗糖离心法测定［23］。

1.2.4 根系及土壤AM真菌的测序 取20条根系样品，采用CTAB法［24］提取根系DNA；取0.5 g冷冻土样，利用试剂盒（TIANamp Soil DNA Kit）进行微生物DNA提取，提取过程严格遵照试剂盒操作说明进行。之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，并取适量样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng·μL-1。

选用特异性引物AML1/AML2［25］与AMV4.5NF/AMDGR［26］进行嵌套式PCR（nested PCR）扩增，扩增后的PCR产物使用1×TAE浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行纯化，切胶回收目标片段。然后交由上海派诺森生物科技有限公司克隆测序。

1.3 数据处理

利用SPSS 24.0进行处理间土壤性质、苜蓿生物量、酶活性及土壤孢子数量的单因素方差分析，同时分别对土壤和根系AM真菌α多样性进行处理间单因素方差分析；而处理间菌根侵染率数据采用Kruskal-Wallis检验进行差异分析。α多样性指数（Shannon和Simpson指数）和丰富度指数（Chao1和ACE指数）根据高通量测序结果获得的操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）数据计算获得。以下指标采用R进行统计分析：利用Pearson相关性进行因子间关系分析；利用基于Bray-Curtis距离的非度量多维测度分析（non-metricmultidimensional scaling，NMDS）及置换方差分析（permutational MANOVA，PERMANOVA）比较处理间AM真菌的β多样性变化；利用基于距离的冗余分析（distance-based redundancy analysis，dbRDA）进行AM真菌群落结构与因子间关系的分析。

2 结果与分析

2.1 翻埋与覆盖对紫花苜蓿生物量及土壤性质的影响

林木枝条3种处理方式均显著提高了紫花苜蓿地上生物量（表1），即WB、W和M处理下紫花苜蓿的生物量分别是CK紫花苜蓿生物量（227.48 g·m-2）的1.77倍、1.60倍和2.29倍（P＜0.05）。然而，土壤水分仅有处理WB显著高于CK（P＜0.05），同时WB土壤水分亦显著高于W（P＜0.05）。此外，WB处理下土壤pH值显著低于CK（P＜0.05），但林木枝条的3种处理方式间的pH值差异不显著（P＞0.05）。对土壤养分的分析结果表明（表1），林木枝条的3种施用方式均不同程度地提高了土壤养分，且总体上以WB在处理间表现出最佳的趋势。脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶活性在处理间的变化与养分变化类似，亦以WB处理下土壤中3种酶活性最高，但过氧化氢酶活性在处理间差异不显著（P＞0.05）。

表1 翻埋与覆盖对土壤性质及紫花苜蓿地上生物量的影响Table 1 Effects of incorporated and mulched tree branches on soil properties and aboveground biomass of alfalfa

2.2 翻埋与覆盖对紫花苜蓿根系AM真菌侵染状况及土壤孢子数量的影响

根系总侵染率、丛枝侵染率、菌丝侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子数在处理间均表现出WB＞M＞W＞CK的趋势（图1），且以上指标在WB处理下的值均分别显著高于CK（P＜0.05），同时WB处理下的丛枝侵染率和泡囊侵染率均分别显著高于W处理（P＜0.05）。相关性分析显示（图2），根系总侵染率、丛枝侵染率、菌丝侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子数均与紫花苜蓿生物量、土壤水分、土壤养分及酶活性（除过氧化氢酶外）间呈正相关，而与pH值呈负相关（P＜0.05）。

图1 翻埋与覆盖对苜蓿根系丛枝菌根真菌侵染率和土壤孢子数的影响Fig.1 Effects of incorporated and mulched tree branches on arbuscular mycorrhizal fungi infection rate of alfalfa and soil spore number

图2 丛枝菌根真菌侵染状况与土壤因子间的相关性分析Fig.2 Correlation analysis between arbuscular mycorrhizal fungi infection and soil factors

2.3 翻埋与覆盖对AM真菌α多样性的影响

研究结果显示（表2），翻埋与覆盖对土壤AM真菌α多样性均无显著影响（P＞0.05）。然而，与CK相比，处理WB显著提高了根系AM真菌的Chao1指数和ACE指数（P＜0.05），但其他处理的α多样性指标与CK间对应指标的差异均不显著（P＞0.05）。相关性分析表明（表3），土壤AM真菌α多样性与苜蓿生长及土壤因子无显著相关性（P＞0.05），但根系Chao1指数和ACE指数与无机氮、碱性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈显著正相关（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 翻埋与覆盖对沙化土壤与根系AM真菌α多样性的影响Table 2 Effects of incorporated and mulched tree branches on α-diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in soils and alfalfa roots

表3 AM真菌α多样性与苜蓿生物量及土壤因子间的相关性Table 3 Correlation between α-diversity of AM fungi with alfalfa biomass and soil property

2.4 翻埋与覆盖对AM真菌β多样性的影响

PERMANOVA与NMDS分析结果表明，WB处理下的土壤AM真菌群落结构与CK、M及W间均存在显著性差异（P＜0.05），同时W和CK间土壤AM真菌群落结构亦显著不同（P＜0.01，图3a）。然而，处理间根系AM真菌的群落结构不同于土壤，即只有WB和M间的AM真菌群落结构差异显著（P＜0.05，图3b）。dbRDA分析表明（图4），土壤中的AM真菌群落结构与紫花苜蓿地上生物量、全磷含量、无机氮含量、脲酶活性及蔗糖酶活性显著相关（P＜0.05或P＜0.01，图4a），而根系AM真菌群落结构和紫花苜蓿地上生物量、有机碳含量、无机氮含量、速效磷含量及过氧化氢酶活性显著相关（P＜0.05或P＜0.01，图4b）。据此，紫花苜蓿地上生物量和无机氮含量是同时影响土壤和根系中AM真菌群落结构的主要因子。

图3 AM真菌群落结构在土壤（a）和根系（b）中NMDS与PERMANOVA分析Fig.3 NMDS and PERMANOVA analysis of arbuscular mycorrhizal fungi community structure in soil（a）and root（b）

图4 土壤（a）与紫花苜蓿根系（b）中AM真菌群落结构与因子间的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis between community structure of arbuscular mycorrhizal fungi and its factors in soil（a）and root（b）respectively

3 讨论

3.1 翻埋与覆盖对紫花苜蓿根系AM真菌侵染率及沙化土壤孢子数的影响

AM真菌在植物根系的侵染定殖与土壤理化因子有关［27］。本研究表明，紫花苜蓿根系总侵染率、丛枝侵染率、菌丝侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子数均与土壤水分、土壤养分及酶活性间呈正相关，而与pH呈负相关。冯固等［28］研究发现，AM真菌侵染率及产孢能力随土壤养分的变化而有所不同。同样在本试验中，与CK相比，由于林木枝条翻埋+覆盖处理（WB）下的土壤水分、养分含量及酶活性（过氧化氢酶除外）较其他处理最高，而pH最低，致使WB处理下的紫花苜蓿根系AM真菌侵染率和土壤孢子数亦最高，说明WB处理可以有效促进AM真菌在土壤和植物中的侵染定殖。同时，AM真菌在植物根系侵染率的提高也会促进植物的生长［13］，而且本研究结果显示紫花苜蓿地上生物量与菌根侵染率及孢子数之间存在显著正相关。此外，李胜宝等［29］的研究结果表明，AM真菌可以促进土壤中添加秸秆的降解，利于土壤养分含量的提高。因此，WB处理由于改善了土壤水分条件，将更有利于促进包括AM真菌在内的微生物对林木枝条及土壤中其他有机物的分解，利于土壤有机碳及其他养分含量的提高。还有研究显示，接种AM真菌显著增加了土壤脲酶的活性及作物秸秆氮素的释放量［30］，本研究结果中WB处理与其类似，因为WB处理方式显著促进了AM真菌侵染，进而土壤脲酶活性得以提高及枝条氮素得以分解释放。总之，与CK相比，WB处理在促进AM真菌侵染、土壤养分提高及植物生长方面均具有积极的作用，是未来干旱半干旱区沙化土壤可供选择的一种措施。

在黄土高原旱作农田的研究表明，秸秆覆盖亦能显著提高土壤AM真菌的丰富度（AM真菌种数）［31］，但也有秸秆覆盖可增加或降低AM真菌侵染率的研究结果［32］。本研究表明，林木枝条覆盖虽然没有显著影响紫花苜蓿根系总侵染率、丛枝侵染率、菌丝侵染率、泡囊侵染率及土壤孢子数，但覆盖措施总体上表现出促进AM真菌侵染率的趋势。此外，由于WB处理中长枝覆盖遮荫对紫花苜蓿的生长具有一定的抑制作用［10］，导致紫花苜蓿地上生物量在覆盖处理（M）下高于WB处理，这也可能是M处理表现出能够促进AM真菌侵染率的原因，因为相关性分析亦表明紫花苜蓿生物量与AM真菌侵染率显著正相关。此外，还有研究表明，秸秆覆盖可以促进AM真菌类群中腐生营养型真菌丰度的升高，有助于土壤养分的提升［33］，而且土壤中添加作物秸秆并接种AM真菌处理能不同程度地增加土壤养分和植物生物量［34］。本研究结果显示，与CK相比，虽然翻埋林木枝条处理（W）对土壤养分含量和酶活性亦具有促进作用，但是W处理下的紫花苜蓿生物量及土壤水分含量与CK无显著差异，这可能也是处理W未能显著促进AM真菌侵染率的原因。总之，处理间AM真菌的侵染率总体表现为WB＞M＞W＞CK的趋势，特别是WB可以显著改善土壤水分条件，同时为植物生长和AM真菌定殖创造有利条件，而AM真菌的成功定殖又为促进植物的生长进一步创造了有利条件。

3.2 翻埋与覆盖对沙化土壤及紫花苜蓿根系AM真菌群落结构的影响

前人关于秸秆还田的研究结果表明，翻埋秸秆可以显著提高AM真菌物种丰富度和多样性指数，但对β多样性的影响不显著［35］，但也有秸秆还田对AM真菌β多样性的影响显著的研究实例［36］。还有研究显示秸秆和有机肥翻埋显著提高了AM真菌物种丰富度和多样性指数，并同时改变了β多样性［5］。因此，有机物料添加对AM真菌α多样性及β多样性的影响可能还与被改良的土壤性质有关。在本研究中，虽然翻埋+覆盖处理（WB）显著提高了根系AM真菌的Chao1指数和ACE指数，但翻埋（W）或覆盖（M）处理对土壤及植物根系α多样性无显著影响。李雪静等［37］发现土壤中有机质、全碳、全氮及水分条件均显著影响AM真菌的多样性。然而，本研究相关分析的结果表明，WB与CK相比由于显著提高了土壤无机氮含量及促进了碱性磷酸酶与蔗糖酶活性，因而提高了Chao1指数和ACE指数，说明无机氮在高C/N林木枝条添加下对AM真菌α多样性的影响更为重要。Li等［9］的前期研究也发现，利用高C/N林木枝条改良土壤时短期内会造成土壤C/N的失衡，使得提高无机氮含量成为林木枝条改良土壤时需要注意的重要因素。然而，本研究结果表明，在林木枝条改良8年后的土壤中，其无机氮含量均显著高于CK，而且3种林木枝条改良措施中以WB处理下的土壤无机氮含量最高。因此，WB处理对根系AM真菌的Chao1指数和ACE指数的提高与该处理下土壤中无机氮含量亦最高密切相关。此外，AM真菌α多样性与酶活性间的显著正相关说明AM真菌α多样性的提高与土壤微生物活性呈正相关，这与Alguacil等［19］的研究结果类似，进一步说明3种林木枝条改良方式中，WB处理的土壤脲酶、碱性磷酸酶及蔗糖酶活性最高亦与其AM真菌α多样性最高密切相关。因此，WB处理较M和W更有利于促进土壤AM真菌α多样性及其活性，利于干旱半干旱地区土壤的改良。

本研究β多样性分析结果显示，WB处理下土壤AM真菌群落结构与CK、W及M均出现显著分离，WB处理下的紫花苜蓿根系AM真菌群落结构与CK亦出现显著分离，说明翻埋+覆盖的组合处理显著改变了土壤及植物根系中AM真菌的群落结构。进一步的研究表明，紫花苜蓿地上生物量和无机氮含量是同时影响土壤和根系中AM真菌群落结构的主要因子，说明紫花苜蓿与AM真菌之间存在协同互利的关系，这与接种AM真菌可以促进植物生长的研究结果类似［38］。然而，前人的研究已表明，AM真菌在磷素循环中扮演着重要作用，可分泌大量磷酸酶活化有机磷，并通过菌丝吸收和运输磷的过程促进植物对无机磷的吸收［39］，本研究中土壤无机氮与AM真菌群落间的关系更为密切的结果与其不一致，进一步说明无机氮是林木枝条改良土壤过程中对AM真菌影响最主要的因子之一。此外，Li等［9］前期研究也表明，在高C/N林木枝条添加下土壤中的氮素可能对植物及微生物生长更为重要，因而无机氮也显著影响了AM真菌的群落结构，这与Liu等［5］利用秸秆改良土壤的研究结果类似。RDA模型结果还显示紫花苜蓿地上生物量和无机氮含量是同时影响土壤和根系中AM真菌群落结构的主要因子，这进一步说明AM真菌与植物生长之间存在显著的正相关。同时，Shu等［40］利用不同有机改良剂研究亦发现，微生物多样性和群落结构与作物产量呈显著正相关，说明土壤微生物多样性是通过提高土壤微生物功能来驱动作物产量的重要因子。因此，综合分析，WB不仅可以显著改善AM真菌的群落结构和功能，而且为AM真菌与紫花苜蓿的共生创造了有利的条件，促进了紫花苜蓿的生长。

4 结论

与翻埋（W）和覆盖（M）相比，翻埋与覆盖的处理组合（WB）在土壤及植物根系AM真菌的侵染定殖以及AM真菌群落结构与活性的改善方面均具有显著的促进作用，表现出3种林木枝条处理方式中以翻埋与覆盖的处理组合下的AM真菌侵染率最高、土壤孢子数最多及α多样性较高，而AM真菌活性的提高又促进了土壤碳氮等养分的循环和植物的生长。因此，翻埋与覆盖的处理组合作为将来干旱半干旱地区沙化土壤改良的一种措施是可行的，具有一定的推广应用价值。