氢氧包衣茶提取物（EGCG）对兔耳痤疮模型的影响

李 睿，方跃华，林雨虹

（1.福州市第一医院皮肤科；2.福州市第一医院检验科，福建 福州 350000）

痤疮是一种累及面部毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病。痤疮好发于青春期，中国人群截面统计痤疮发病率为8.1%[1]，是常见的皮肤疾病。痤疮的发病机制与雄激素刺激皮脂腺分泌旺盛、痤疮丙酸杆菌等微生物感染，免疫介导炎症反应等密切相关[2]。痤疮的治疗有外用药物治疗、系统药物治疗、物理和化学治疗、中医和中药治疗等，其中外用药物是基础治疗。目前痤疮的外用药物治疗主要有维A酸类乳膏，外用抗菌药物类以及水杨酸等其他外用药物。外用维A酸类药物以及抗菌药物中的过氧化苯甲酰有不同程度的皮肤刺激，可以造成皮肤屏障功能受损。抗菌药物中的抗生素外用容易引起痤疮丙酸杆菌耐药[1]。

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是从绿茶中提取的一种多酚类成分，是绿茶儿茶素中含量最高的组分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗突变、抗辐射和紫外线等作用[3]。有学者研究发现EGCG还具有抑制细菌繁殖、抑制皮脂腺细胞生长和分泌、抗炎等作用[4-7]，这些作用与痤疮发病机制相关，因此EGCG对于治疗痤疮，可能有效果。但是，因为皮肤屏障的保护和吸收作用，外用药物发挥作用必须要有合适的剂型使之有一定程度的透皮渗透。透皮吸收因子TAF是一种新型的透皮技术，该技术通过臭氧促透，剪切、包衣等步骤，使活性成分能透过皮肤屏障。

因现有痤疮外用药物的局限性，研究开发有效、安全副作用小的新型外用药物存在临床需求。本研究利用新型的TAF透皮生物技术对EGCG进行处理，形成新剂型EGCG，即氢氧包衣EGCG，我们通过研究其对痤疮形成机制相关方面的影响，探索痤疮外用药物治疗的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

12周龄雄性新西兰大白兔，体重2.5-3kg（赣州市畜牧水产研究所），98%EGCG（西安东峰生物科技有限公司），痤疮丙酸杆菌（BNCC336649，北纳生物），0.025%维A酸乳膏（重庆华邦制药有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 利用TAF技术（江苏朗沁科技有限公司）对98%EGCG进行氢氧包衣，形成包衣EGCG。

1.2.2 活化痤疮丙酸杆菌。称取BHI脑心浸液肉汤取19.25g，加蒸馏水定容至500mL，121℃高压灭菌20min，取出冷却至室温备用；0.1‰维生素和0.1‰氯化血红素通过0.22μm滤膜过滤除菌后，加入到冷却的BHI脑心浸液肉汤中，再存放至4℃冰箱备用。取50mL BHI培养基，按1% (v/v)接种比例来滴加500μL痤疮丙酸杆菌浓缩菌液进行厌氧培养。

1.2.3 建立兔耳痤疮模型。选取24只12周龄雄性新西兰大白兔，饲养于温度18℃-26℃，湿度40%-70%条件下。在经过1周的适应性饲养后，对兔子左耳内耳构建兔耳痤疮模型。在兔子左耳内耳中央附近涂抹2%粗煤焦油，0.5ml，范围为2×2-4×4CM2。连续两周，从给煤焦油第7天起，隔天皮内多点（6点）注射0.2ml痤疮丙酸杆菌溶液（3×108/ml）于兔耳涂煤焦油处，共4次进行动物模型构建。

1.2.4 为了探究包衣EGCG治疗兔耳痤疮的关系，将动物分为Control、Model、维A酸乳膏组（建模第一天起同时涂抹维A酸乳膏5mg/kg/d，共14天）、包衣EGCG（建模第一天起同时涂抹包衣EGCG，20mg/只/天，共14天）。

1.2.5 HE染色。切取各组实验区域皮肤组织，制作石蜡切片，石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用苏木素染液染色3min-5min，流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，反蓝液反蓝，伊红染色3min-5min后，切片脱水，封片，在显微镜（BX43，Olympus）下观察组织病理变化情况。

1.2.6 RT-qPCR检测。采用Trizon试剂提取皮肤组织中的总RNA，采用RNA超纯提取试剂盒提取mRNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度（OD260/OD280），通过RNA逆转录试剂盒合成cDNA，采用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应步骤如下：预变性95℃，10min；变性95℃，10s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；40个循环。以GAPDH作为内参，基因的相对表达量根据2-△△Ct法计算。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3 统计学处理

采用SPSS 18统计学软件进行数据分析。计量资料用（)表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

如图1结果显示，Control组兔耳柔软、薄白、毛细血管清晰，兔耳管开口处可见毛孔大小均匀，皮肤组织完整。Model组皮肤表皮明显角化增厚、棘层细胞层数增多、毛囊扩张、毛囊面积增大。维A酸乳膏治疗组和包衣EGCG组治疗后表皮均出现角化厚度减小、棘层细胞层数均减少，毛囊扩张程度减轻，毛囊面积减小。

图1 （HE染色，200×）

2.2 RT-qPCR检测

如图2结果显示，与Control组相比，Model组IL-1a、IL-8、IL-6促炎因子显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Model组相比，维A酸乳膏组、包衣EGCG组治疗后IL-1a、IL-8、IL-6炎症因子均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 qPCR检测IL-1a、IL-6、IL-8、NF-κB基因表达水平

3 讨论

绿茶是一种具有中国特色的食品，也受到世界上其他国家和地区的人们的喜爱。不仅饮用绿茶的养生功能被不断地发现与开发，绿茶提取物还是世界范围内极受欢迎的护肤品的添加成分。茶多酚是从茶叶中提取的一类多酚类的物质，其中儿茶素的占比最高，儿茶素主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）表没食子儿茶素（EGC）表儿茶素没食子酸酯（ECG）表儿茶素（EC）[8]。其中EGCG含量最高，具有较强、较多的生物活性。针对痤疮的发病机制，EGCG在抑制皮脂分泌方面，可以通过活化MAPK通路，激活Nrf2通路及下游基因，达到抑菌、抗炎及抑制皮脂分泌的作用，并且可以减少自噬抑制因子mTORC的表达，促进细胞自噬，从而抑制皮脂分泌[9]。EGCG的抗炎机制，一方面与其的抗氧化作用相关，EGCG可以通过清除自由基和氧化剂，抑制氧化应激性，减轻氧化剂介导的损伤；通过抗氧化及阻碍细胞内钙离子的流动抑制MCP-1的高表达，抑制转录因子STAT1的激活。除此之外，EGCG还可以干预NF-κB信号通路、抑制转录因子NF-κB从而发挥抗炎作用[10-11]。

虽然EGCG在体外有诸多的活性和作用，但是临床使用却受限，主要原因是EGCG的化学结构极不稳定，容易受到各种环境及理化因素的影响，因此，EGCG在体内分解快，生物利用度较低。在外用于皮肤的治疗应用中，又因为EGCG具有较高的水溶性，导致它在皮肤的渗透性差[12]。因此，如何提高EGCG的稳定性和生物利用度是近来研究的热点。在外用药品或化妆品中，为了使活性成分更好地发挥作用，通常会使用促透剂，促进有效成分的透皮。经过对促渗剂的深入研究，大多数促渗剂都表现出不同程度的局部或全身毒性。随着透皮技术的进展，出现了新的剂型如脂质体、微乳、纳米粒等[13]。TAF技术也是一种新型的透皮吸收技术，该技术可以可逆的改变皮肤屏障脂质的排列构型，扩大细胞间隙，使细胞间的透过能力增大，并能改变分配系数，增加细胞旁路转运，使被包衣成分深入皮肤表皮层，真皮层至皮下组织，克服了水溶性成分透皮吸收差的缺点。而本次研究的结果也呈现了经过TAF技术进行氢氧包衣后的EGCG对于兔耳痤疮模型的治疗效果与0.025%维A酸乳膏相当，为EGCG治疗痤疮提供了新的思路。对于氢氧包衣的EGCG是否能用于临床上痤疮的治疗，还需要更多方面，更加深入，更大样本的研究。