基于生物信息学分析筛选肺腺癌免疫预后相关lncRNA

思璐，秦秋雯，沈印，罗双艳，何颖，张裕旭，刘柳

（广西壮族自治区人民医院国际医疗部，广西 南宁 530021）

2018 年国际癌症研究机构（IARC）的数据表明[1]，全球绝大多数国家的肺癌发病率和死亡率均居首位，其中肺腺癌是所有肺癌中最常见的亚型，约占所有肺癌的40%。手术治疗、放化疗在肺腺癌的治疗中起着关键作用[2-4]，但有50%的肺腺癌患者死于肿瘤复发[5]，因此识别肺癌预测预后生物标记物，可为患者提供早期、有效的治疗。lncRNA（IRL）是由长度超过200 个核苷酸的组成的RNA，因缺少开放阅读框，不具备编码蛋白质的能力[6]，但其可通过碱基互补配对，与DNA、RNA、蛋白质相互作用发挥生物学功能[7，8]。近期研究发现[9]，IRL 通过调控T 细胞亚群的凋亡敏感性进而改变肿瘤微环境中T 细胞亚群的平衡，造成肿瘤的免疫逃逸。免疫系统在癌症的发展进程中起着关键作用[10]。多项研究表明[11，12]，可通过鉴定免疫相关的基因以预测癌症患者的生存预后。本研究通过使用TCGA 数据库和Molecular Signatures Database v7.0 的数据，利用生物信息学的方法来鉴定潜在的免疫相关的预后性IRL 生物标志物，以期用于肺腺癌患者的预后预测。

1 材料与方法

1.1 数据来源 IRL 表达数据和相应的临床数据均从TCGA 数据库下载（https://portal.gdc.cancer.gov）。筛选条件如下：①肿瘤原发位点：肺癌；②病理类型：肺腺癌；③数据类型：TCGA-基因表达定量；④其余筛选条件默认或不选。根据肿瘤患者的生存时间来构建预后模型，排除临床数据不完整和总体生存率＜30 d 的肿瘤标本[13]，最终符合要求的有455 例肿瘤患 者。Molecular Signatures Database v7.0（http://software.broadinstitute）下载免疫相关的基因集（immune system process M13664，Immune response M19817）。通过构建免疫基因共表达网络，鉴定了1124 个免疫相关的IRL。

1.2 方法

1.2.1 数据处理及基因共表达分析 通过strawberry-Perl（版本5.30，64bit）将IRL 表达数据与相应临床数据整合。R 软件“limma”包（版本3.6.1）鉴定免疫相关的IRL，P＜0.001 表示差异有统计学意义。

1.2.2 筛选预后相关的IRL 通过R 软件“survival”包进行单因素Cox 回归分析，P＜0.001 认为差异有统计学意义。通过R 软件“glmnet”包和“survival”包对有单因素Cox 回归分析结果中有统计学意义的IRL进行Lasso 回归分析，筛选出影响肺腺癌预后的关键IRL。采用多变量Cox 回归分析构建风险模型，根据所选IRL 的基因表达量和系数计算每个NSCLC患者的风险评分，其公式为risk core=G1×β1G1+G2×β2G2+…Gn×βnGn。其中，n 为纳入基因的个数，G 代表基因的表达量，β 代表基因的系数[14]。将风险评分的中位数设为截断值，风险评分≥中位数为高风险组，风险评分＜中位数为低风险组。

1.2.3 预后模型评价 运用Kaplan-Meier（K-M）生存分析评估低风险组和高风险组的生存差异。此外，采用ROC 曲线比较风险评分模型与其他临床性状对预后预测的准确性。ROC 曲线分析采用R 软件“survival ROC”包（版本3.6.1）进行。AUC＜0.5 表示不显著，0.5～0.7 表示准确率较低，0.7～0.9 表示准确率中等，＞0.9 表示准确率较高[15]。

2 结果

2.1 筛选肺腺癌预后相关的IRL 首先从TCGA 数据库筛选出符合条件的肺腺癌样本数据共455 例。通过R 软件“limma”包（版本3.6.1）构建免疫基因共表达，鉴定了1124 个IRL，Coef≥0.4且P＜0.001。通过单因素Cox 回归分析，初步筛选出18 个和肺腺癌预后相关的IRL，见图1。为避免单因素Cox 回归分析过度拟合问题，通过Lasso 回归分析对预后相关的IRL 进行二次选择，得到14 个IRL 与肺腺癌的生存预后相关，见图2。

图1 单因素Cox 回归分析森林图

图2 Lasso 回归分析图

2.2 构建IRL 风险模型和评价

2.2.1 构建风险模型 将Lasso 回归分析确定的14个IRL 纳入多因素Cox 回归分析构建风险模型，最后得到由8 个IRL 组成预后分险模型，见图3。根据这8 个IRL 在样本中的表达量分析计算每个患者的预后风险值：风险值=LINC01116 的表达量×（0.213）+AL034397.3的表达量×（-0.248）+AC123595.1 的表达量×（-0.601）+AL606489.1 的表达量×（0.285）+AL365203.2量的表达×（0.297）+AC245595.1 的表达量×（0.272）+AC011477.2 的表达量×（-0.276）+AL049836.1 的表达量×（0.3305）。

图3 多因素Cox 回归分析图

2.2.2 评价风险模型 K-M 生存分析显示，低风险组生存时间长于高风险组（P＜0.001），见图4。ROC 曲线分析结果显示，风险评分、年龄、性别、分期、T、M、N 对肺腺癌预后的曲线下的面积分别为0.785、0.498、0.579、0.733、0.673、0.508、0.685，见图5。此外，对风险模型绘制风险曲线，结果显示随着风险值的升高，患者生存时间逐渐下降，死亡人数逐渐增多，其中AL034397.3、AC026355.1、AC011477.2 为低风险的基因随着风险值的增大，表达量逐渐下降；AL365203.2、LINC01116、AL606489.1、AC245595.1、AL049836.1 为高风险的基因随着风险值的增大，表达量逐渐升高，见图6。

图4 K-M 生存分析

图5 ROC 曲线图

图6 风险曲线图及热图

图6 风险曲线图及热图（续）

3 讨论

随着基因芯片技术及高通量测序技术的发展，基因组的表达数据越来越丰富。TCGA 数据库至今共收录了33 类癌症的基因数据，其中包括mRNA、lncRNA、microRNA等[16，17]，极大的促进了癌症分子基础研究。近期研究表明[18，19]，IRL 在多种疾病的病理及生理途径中发挥重要作用，这为疾病的诊断和治疗方法提供新契机。此外，IRL 通过染色质修饰、转录和翻译过程参与基因的表达调控与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移、免疫[20-23]。肿瘤免疫是机体对肿瘤细胞产生的特异性免疫反应，近年来肿瘤免疫研究取得了重大突破。Huang D等[24]研究发现，IRL通过调控T 细胞亚群的凋亡敏感性，从而改变肿瘤微环境中免疫激活及免疫抑制的T 细胞亚群的平衡，造成肿瘤的免疫逃逸。Sun X等[25]通过免疫基因共表达分析构建了一个免疫相关的lncRNA 模型以预测卵巢癌患者的预后、药物敏感性和免疫状态，促进了卵巢癌患者的个体化治疗。

多项研究证实[26-28]，IRL 与肿瘤诊断、治疗、预后有显著相关性。然而目前免疫相关的IRL 在肺腺癌的预后预测少有报道。本研究通过免疫基因共表达网络共鉴定1124 个IRL，单因素Cox 回归分析得出18 个IRL 可能与预后相关。考虑单因素Cox 回归分析每次仅纳入一个变量，存在过度拟合的缺点，本研究在此基础上再次引入Lasso 回归分析，通过交叉验证λ值，对纳入Cox 回归分析的lncRNA 进行二次选择。最后，通过多因素Cox回归得出由LINC01116、AL034397.3 AC123595.1、AL606489.1、AL365203.2、AC245595.1、AC011477.2、AL049836.1 构建的预后风险模型与生存预后显著相关。此外，本研究中采用中位数截断值进行分组，结果显示低风险组生存时间长于高风险组（P＜0.001）；ROC 曲线分析结果显示，风险评分、年龄、性别、分期、T、M、N 对肺腺癌预后的曲线下的面积分别 为0.785、0.498、0.579、0.733、0.673、0.508、0.685。此外，对风险模型绘制风险曲线，结果显示随着风险值的升高，患者生存时间逐渐下降，死亡人数逐渐增多，其中AL034397.3、AC026355.1、AC011477.2 为低风险的基因随着风险值的增大，表达量逐渐下降；AL365203.2、LINC01116、AL606489.1、AC245595.1、AL049836.1 为高风险的基因随着风险值的增大，表达量逐渐升高，提示AL034397.3、AC026355.1、AC011477.2 可作为肺腺癌预后的危险因素，而AL365203.2、LINC01116、AL606489.1、AC245595.1、AL049836.1 可作为肺腺癌保护性的预后因素。因此，8 个IRL 构建的风险模型可为肺腺癌患者的生存提供准确的预测和评估，同样为肺癌预后的基础实验研究提供更多选择的生物标志物。然而本研究存在一定的局限性，如纳入的数据来源于单一数据库，需要在较大队列中进行进一步验证；且目前8 个IRL 在肺腺癌的发生、发展机制以及参与的信号通路等分子生物机制尚不明确，仍需基础实验进一步验证。

综上所述，通过挖掘TCGA 数据库构建的8 个IRL 肺腺癌预后模型有望成为肺腺癌的预后评估生物标志物。