茶树种质资源汝城白毛茶的代谢物差异研究

赵 熙，赵 洋，杨培迪，宁 静，杨 阳，成 杨，刘 振

湖南省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心湖南分中心/湖南省茶树品种与种苗工程技术研究中心，湖南长沙 410125

汝城白毛茶原产于罗霄山脉东段九龙江次生森林一带，是湖南四大茶树地方群体资源之一，也是白毛茶变种（Camelliasinensisvar.pubilimbaChang）的一个典型代表[1]。研究表明汝城白毛茶不仅在演化地位上与湖南其他3个地方群体资源差异较大，而且在植物学特征、生化成分、制茶品质等方面特色鲜明[2]。

目前对汝城白毛茶生化成分的研究主要集中在水浸出物、咖啡碱、氨基酸、茶多酚、儿茶素组分等方面，而对于其深度的功能成分研究相对较少[3]。近年来随着人们物质生活水平的提高，高功能成分特异茶树种质资源的发掘与利用越来越受到研究者的关注[4-5]。研究表明，不同地方茶树资源由于长期的演化和引种驯化，在功能成分方面具有较大差异[1]。通过对不同地方茶树资源的鉴定评价，已在茶氨酸[6]、苦茶碱[7]、黄酮[8]、β-胡萝卜素[9]等检测工作中取得了一定的进展，筛选出了一些功能成分特异的茶树资源（品种），这些品种的推广极大地带动了当地茶产业发展[4]。因此对于汝城白毛茶资源的代谢物差异研究不仅对汝城白毛茶的选育、开发具有重要意义，而且对于探明汝城白毛茶驯化分子机理研究也具有重要的参考价值。

代谢组学技术是一种可以在很宽范围内对生物样品中代谢物进行全面定量分析的技术，具有高效、全面及准确的特点[10-11]。同时，结合多元统计分析技术不仅可以在模型水平进行评价，而且可以寻找潜在性差异代谢物[12]。代谢组学已在茶叶的生理代谢[13]、加工过程的成分变化[14-15]、特征成分的挖掘等[16]方面有了一定的应用。本研究以湖南典型地方茶树群体资源为对照，采用UPLC-MS/MS分析技术，研究并筛选汝城白毛茶的差异代谢产物，以期为汝城白毛茶茶树种质资源的筛选、加工工艺研究和驯化分子机理探索等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究采用的汝城白毛茶（RCBM）、城步峒茶群体（CBDC）、江华苦茶群体（JHKC）和安化群体（AHQT）样品采自于湖南省茶树种质资源圃，春季采摘第一批一芽一叶，样品采集后在液氮中冷却并进行冷冻干燥。

1.1.2 仪器与试剂 仪器：FD-56真空冷冻干燥机，美国SIM公司；MT203T电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；5424R离心机，德国 Eppendorf公司；MM 400研磨机，德国RETSCH公司；CBM30A超高效液相色谱，日本岛津公司；4500 QTRAP串联质谱（MS/MS），美国Applied Biosystems公司。

试剂：乙醇、甲醇、乙腈，国产；标准品：二甲基亚砜或甲醇作为溶剂溶解后，保存条件-20℃，质谱分析前采用 70%甲醇稀释成合适浓度（美国，Sigma-Aldrich），试剂均为色谱纯。

1.2 方法

UPLC-MS分析。数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography, UPLC）和串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）。色谱柱：SB-C18 Agilent 1.8 µm，2.1 mm×100 mm；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈；洗脱梯度：0 min B相比例5%，9.00 min内B相比例线性增至95%，维持1 min，10.00~11.10 min，B相比例降至5%，并平衡至14 min；流速为0.35 mL/min；柱温为40℃；进样量4 µL。质谱条件参照CHEN等[10]的方法。

1.3 数据处理

基于迈维生物科技公司的植物广靶代谢数据库，对样本的代谢物进行质谱定性分析，采用 MultiaQuant软件进行色谱峰面积和对应物质相对含量的确定。采用变量重要性投影值（variable importance in projection, VIP）和差异倍数值（fold change, FC）对正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结果进行差异代谢物筛选，VIP值大于1可判定为差异显著的代谢物，同时含量增加的代谢物 FC≥2或含量减少的代谢物FC≤0.5。

2 结果与分析

2.1 汝城白毛茶的差异代谢物筛选

共有609个代谢物在4个群体中被检测出。以安化群体、城步峒茶、江华苦茶3个群体为对照组，采用 OPLS-DA分析方法，基于显著差异代谢物的筛选依据，分别在汝城白毛茶中筛选到显著差异代谢物189、180、162个（图1），其中差异代谢物最多的为黄酮类（69、51、60个），其次为酚酸类（31、40、25个），最少的为木脂素和香豆素（5、4、4个）。

图1 汝城白毛茶与其他3个群体的差异代谢物比较Fig.1 Comparison of metabolites in Rucheng Baimaocha with other three populations

2.2 与3个群体显著差异代谢物比较

为挖掘汝城白毛茶中含量较高的差异代谢物，本研究将汝城白毛茶分别与湖南其他典型地方群体资源间含量增加的差异代谢物进行比较分析，结果表明，汝城白毛茶中含量增加最多的代谢物均为黄酮，其次为酚酸类，其中含量增加最高的物质均为乔松素。比安化群体显著增加的代谢物共93种，与茶叶品质密切相关、有CAS号且Log2FC＞2的代谢物共20个；比城步峒茶显著增加的代谢物共91种，与茶叶品质密切相关、有CAS号且Log2FC＞2的代谢物质共18个；比江华苦茶群体显著增加的代谢物共67种，其中与茶叶品质密切相关、有CAS号且Log2FC＞2的代谢物共15个（表1）。将不同群体中汝城白毛茶含量显著增加的代谢物进行比较，汝城白毛茶较其他 3个群体含量均增加的代谢物共15个（图2，表2），表明这些物质在汝城白毛茶群体中的含量较高。

表2 在3个群体中含量均增加的代谢物（Log2FC＞1）Tab.2 Metabolites increased in all three population (Log2FC＞1)

图2 汝城白毛茶与3个群体差异代谢物的韦恩图Fig.2 Venn map of differential metabolites among three population

表1 与3个不同群体比较含量显著增加的物质（Log2FC＞2）Tab.1 Specific increased differential metabolites compared with three different populations (Log2FC＞2)

续表1 与3个不同群体比较含量显著增加的物质（Log2FC＞2）Tab.1 Specific increased differential metabolites compared with three different populations (Log2FC＞2) (continued)

2.3 群体间差异代谢物的K均值聚类

为了研究代谢物在不同样本中相对含量的变化趋势，将差异代谢物相对含量进行标准化处理和中心化处理，然后进行K均值聚类（K-means）分析（图3）。结果表明，4个群体中变化趋势一致的代谢物可分为9类。本研究对变化趋势一致、与茶叶品质密切相关且有 CAS号的差异代谢物进行了筛选，得出汝城白毛茶中含量最高的代谢物共 32个（表3），分布在 1、2、5、7、9共 5个聚类群中，主要为黄酮和鞣质类。

表3 变化趋势一致且在汝城白毛茶群体中含量最高的物质Tab.3 Substances with the same change trend and the highest content in Rucheng Baimaocha

图3 差异代谢物K-means图Fig.3 K-means of different metabolites

2.4 差异代谢物KEGG富集分析

根据差异代谢物的筛选结果，本研究进行了差异代谢物KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，其中Rich factor值越大表示富集程度越大，Pvalue越接近于0，表示富集越显著（图4、图5、图6）。图中圆点越大，代表富集到相应通路上的差异显著代谢物的个数越多。差异代谢物KEGG富集分析结果表明，与安化群体富集显著且个数最多的代谢途径依次为类黄酮生物合成途径、苯丙烷生物合成途径、黄酮与黄酮醇生物合成途径、异喹啉生物碱生物合成途径（图4）；与城步峒茶富集显著且个数最多的代谢途径依次为类黄酮生物合成途径、其次为赖氨酸降解和赖氨酸生物合成途径（图5）；与江华苦茶富集显著且个数最多的代谢途径依次为类黄酮生物合成途径、苯丙烷生物合成途径和黄酮与黄酮醇生物合成途径（图6）。

图4 汝城白毛茶与安化群体差异代谢物的KEGG通路富集Fig.4 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and AHQT

图5 汝城白毛茶与城步峒茶差异代谢物的KEGG通路富集Fig.5 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and CBDC

图6 汝城白毛茶与江华苦茶差异代谢物的KEGG通路富集Fig.6 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and JHKC

3 讨论

黎星辉等[3]对湖南主要地方茶树资源进行了经济性状和主要生化成分含量测定，结果表明，茶多酚与儿茶素含量在不同茶树资源中差异较大，其中汝城白毛茶含量最高，属于高茶多酚资源，其次为江华苦茶和城步峒茶，云台山种含量最低。本研究结果表明，以安化群体、城步峒茶、江华苦茶3个群体为对照，在汝城白毛茶中筛选到了显著差异代谢物最多的均为黄酮类，其次为酚酸类，这与前人的研究结果一致。一方面说明黄酮和茶多酚作为茶叶中的一大类物质，包括的次生代谢物类型在茶叶中数量相对较多，另一方面也说明汝城白毛茶作为湖南的典型地方茶树种质资源，具有较高的茶多酚含量，是一个加工红茶的优异茶树种质资源。

差异代谢物的富集通路对理解品种差异具有重要意义。差异代谢物富集通路研究表明，汝城白毛茶与其他群体的差异代谢物除主要富集于类黄酮、黄酮与黄酮醇生物合成途径外，还在苯丙烷生物合成途径、异喹啉生物碱生物合成途径和咖啡碱代谢途径中有比较显著的富集。苯丙烷类生物合成途径是植物 3条主要次生代谢途径之一，在植物的生长发育过程及应答逆境胁迫中发挥重要作用，如避免植物受逆境胁迫伤害、提高植株抗病能力、生成花和果实的颜色与气味、作为信号传导分子等[17-18]。目前茶树中关于苯丙烷类代谢途径的研究较少，谷梦雅等[19]通过不同强度红光对茶树影响进行了转录组分析，研究表明红光处理可能对茶树苯丙烷类生物合成代谢途径具有重要影响，进而可能影响茶树黄酮类化合物生物合成和木质素合成途径。异喹啉生物碱具有多种生物活性，例如抗肿瘤、抗菌、调节免疫功能等，具有很高的医用价值和广阔的前景，一直是国内外研究开发利用的热点[20]。

前期对汝城白毛茶的差异代谢物研究主要集中在水浸出物、茶多酚、氨基酸等大类物质中，对于更深层次的功能成分差异研究却关注较少。本研究开展了汝城白毛茶通与湖南其他3个典型地方茶树种质资源的差异代谢物研究，通过分析得到在汝城白毛茶中显著增加的差异代谢物，比如乔松素、鞣花酸、山奈酚等，这些代谢物具有良好的抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降低血脂和神经保护等作用，已在一些蔬菜、水果及中药材中有了研究的报道，但目前在茶叶中相关的研究较少[21-23]。因此通过汝城白毛茶含量增加的差异代谢物研究，不仅为后期汝城白毛茶群体资源筛选提供了重要的研究方向，而且也为汝城白毛茶资源的保健功能研究和开发利用提供了重要依据。