蒙古马全身主要骨骼肌表型谱的构建及比较研究

贾紫洁，图格琴，丁文淇，任秀娟，刘慧莹，李欣泽，翠 芳，芒 来*，白东义*

(1.内蒙古农业大学动物科学学院 内蒙古自治区马遗传育种与繁殖重点实验室 农业农村部马属动物种业创新部省共建重点实验室 农业农村部马属动物遗传育种繁殖科学观测实验站 内蒙古农业大学马属动物研究中心，呼和浩特 010018；2.内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗动物疫病预防控制中心，赤峰 025550)

目前关于马运动性能的研究以纯血马和阿拉伯马为主，且只有少数机体组织被评估[1]。纯血马是典型的速度型赛马，以短距离竞赛中速度快而闻名于世[2]。阿拉伯马是耐力赛事的首选马种，其比赛以30～40 km为一赛段[3]。蒙古马在那达慕比赛中单赛段最长达100 km[4]。马肉消费目前处于冷门状态，一些国家发现其有较高的营养价值[5]。马肉含有丰富的蛋白质、氨基酸及不饱和脂肪酸，脂肪含量低于其他家畜，符合人们对健康生活的需要[6]。

根据“十四五规划”加强种质资源的保护与利用[7]，对蒙古马肌纤维测定尤为重要。只有深入了解我国地方马种的优良特性，结合现代生物学技术优化种群，才能摸索出符合我国国情的现代马业发展之路，并达到保护地方良种马的目的[8-9]。蒙古马作为我国著名的地方品种，具有历史悠久、人工选育度低、抗严寒、耐粗饲、抗病力强、耐力强等特性[10]。

马骨骼肌是研究哺乳动物运动性能的合适模型，骨骼肌是机体占比很高的器官，是运动和力量产生的关键[11]。骨骼肌的多样性是由于单肌丝纤维成分复杂且不同类型的肌纤维之间镶嵌分布[12]。肌球蛋白重链(MYHC)影响肌纤维分型，根据肌纤维形态结构、生理功能不同，将肌纤维分为Ⅰ型(慢收缩氧化型)、Ⅱa型(快收缩氧化型)、Ⅱb型(快收缩酵解型)和Ⅱx型(中间型)[13]。不同品种、同一品种不同组织、同一组织不同位置的快慢肌纤维比例均存在差异，并且受年龄、性别等要素的影响。慢肌纤维中神经元较小，神经传导的速度慢，肌肉收缩的速度慢、力量小，但抗疲劳，耐力强；有氧代谢酶的含量高，能量的产生以有氧代谢为主，其拥有丰富的线粒体、肌红蛋白、毛细血管，使肌纤维呈现红色；直径较小；一般用于保持姿势和持续的重复运动。快肌纤维特性反之，因此快肌纤维在短时间内产生大量的能量，在运动中提供爆发力[14]。

动力学和运动学分析表明，头颈部主要作用是保持身体平衡，前肢主要是提供支撑力[15]。肩部悬挂前肢，产生反重力;国外有研究表明，躯干肌肉的主要作用是控制背部的平直，而不是诱发运动[16]。腹壁侧肌肉根据肌肉收缩影响呼吸，参与代谢，影响运动水平[17]。后肢主要产生推进力[18]。

蒙古马肉是内蒙古特色食物，马肉品质指马肉所具有的外观、风味、营养等与加工和食用有关的性状。衡量马肉品质的指标包括色泽、pH、嫩度、失水率等食用指标；水分、灰分、蛋白质、脂肪等化学指标；氨基酸、脂肪酸、矿物质等营养指标[19]。曾有研究表明，颈部pH最高，显著高于胸部、腰部、里脊，里脊pH最低；剪切力较高的是肩部、后肢、前肢和臀部，颈部居中，胸部、腰部、里脊较低[20]。

作为基础知识，建立蒙古马全身主要的骨骼肌表型谱十分重要。本研究采集了蒙古马全身主要骨骼肌进行快慢肌纤维占比的测定，并选取典型的速度型赛马-纯血马与蒙古马进行对比分析，得到快慢肌纤维组成之间的差异。

1 材料与方法

1.1 试验动物样品采集

本研究选取2匹年龄为5岁的雄性蒙古马，身体健康、未调教训练，且体型基本一致。试验动物均来自内蒙古同一马场，生活环境与饲养条件相同。将马匹分为5个部分进行采样，如图1所示。将样品放入固定液中固定，乙醇梯度脱水， 4 ℃保存。

图1 马全身主要骨骼肌位置图

1.2 石蜡切片

通过石蜡切片得到骨骼肌横截面。将无水乙醇中骨骼肌修切成0.5 cm3的组织块，二甲苯透明，浸蜡后包埋，利用切片机(LeicaRM2245)制成组织完整、无损伤、厚度为6 μm的组织切片，70 ℃烘片30 min，晾干备用。

1.3 免疫组化

免疫组化运用抗原与抗体特异性结合原理使标记抗体的显色剂显色，确定抗原，对组织中快慢肌纤维进行定性、定位及相对定量研究。

将组织切片放入二甲苯脱蜡，梯度酒精回水，抗原修复，PBS冲洗，试验流程依据UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒说明书制定，加入试剂A(过氧化物酶阻断液)室温孵育10 min；PBS冲洗加入试剂B(正常非动物免疫血清)室温孵育10 min；去掉试剂B，滴加第一抗体: 1)抗快速肌球蛋白骨骼重链抗体(兔,稀释浓度1∶200, Bioss,中国北京)，该抗体与MHC-II特异性反应；2)抗肌球蛋白-7抗体(兔,稀释浓度1∶200, Bioss,中国北京)，该抗体与MHC-I特异性反应。4 ℃孵育过夜；PBS冲洗加入试剂C(第二抗体)室温孵育10 min；PBS冲洗加入试剂D(链霉菌抗生物素过氧化物酶)室温孵育10 min；PBS冲洗加入DAB，水中终止染色；苏木素复染，自来水冲洗返蓝；无水乙醇洗去杂质；中性树胶封片固定，晾干后避光保存。

1.4 HE染色

HE染色是石蜡切片技术中常用的染色法，苏木精使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着蓝紫色；伊红使细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。

将组织切片放入二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；苏木素染细胞核，自来水冲洗返蓝；伊红染细胞质；95%酒精脱伊红；无水乙醇洗去杂质；中性树胶封片固定，晾干后避光保存。

1.5 切片数据统计

将染色后的组织切片置于显微成像系统，可由图像分析软件选取AOI，再由Image-Pro Plus6.0图像分析软件得到肌纤维的总面积、快慢肌纤维所占面积、视野内肌纤维个数，计算得到快慢肌纤维在所处视野的比例及肌纤维横截面积用于后续分析。

1.6 数据统计分析

将蒙古马26个部位骨骼肌快慢肌纤维比例及肌纤维横截面积按部位分为5组进行统计，并进行相关性分析。将蒙古马26个部位骨骼肌表型数据中24个(除颈锯肌、股四头肌)与已发表文章中纯血马(MINAKO KAWAI，2009)所对应的骨骼肌进行差值分析，并按组进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 蒙古马头颈部骨骼肌肌纤维类型及肌纤维横截面积分析

根据免疫组化染色结果，将肌纤维分为快肌纤维和慢肌纤维，如图2所示；根据HE染色结果计算得到肌纤维横截面积，如图3所示。

A.蒙古马夹肌快肌纤维;B.蒙古马夹肌慢肌纤维。a.快肌纤维;b.慢肌纤维

A.比目鱼肌HE染色;B.腓肠肌HE染色

本研究在头颈部采集了2匹蒙古马的夹肌、胸头肌、颈锯肌共6个肌肉样本(2匹×3个骨骼肌部位)。由表1可知，头颈部骨骼肌的平均快肌纤维占比为42.37%，平均慢肌纤维占比为57.63%；除颈锯肌外其他骨骼肌均为慢肌纤维占更大，肌纤维横截面积均值为505.58 μm2。其中夹肌慢肌纤维占比最大(67.83%)，颈锯肌慢肌纤维占比最小(47.60%)。

表1 蒙古马头颈部骨骼肌肌纤维类型占比及肌纤维横截面积

2.2 蒙古马前肢骨骼肌肌纤维类型及肌纤维横截面积分析

本研究在前肢采集了2匹蒙古马的腕桡侧伸肌、臂三头肌、三角肌、冈下肌、冈上肌、臂二头肌、腕桡侧屈肌共14个肌肉样本(2匹×7个肌肉部位)。由表2可知，蒙古马前肢骨骼肌的平均快肌纤维占比为43.98%，平均慢肌纤维占比为56.02%；其中腕桡侧伸肌、臂三头肌、三角肌、冈下肌为慢肌纤维占比较大，冈上肌、臂二头肌、腕桡侧屈肌为快肌纤维占比较大，前肢骨骼肌的肌纤维横截面积的均值为550.31 μm2。其中腕桡侧伸肌慢肌纤维占比最大(74.63%)，腕桡侧屈肌慢肌纤维占比最小(42.18%)；肌纤维横截面积最小的是慢肌纤维占比较大的臂三头肌，肌纤维横截面积最大的为快肌纤维占比最大的腕桡侧屈肌。

表2 蒙古马前肢骨骼肌肌纤维类型占比及肌纤维横截面积

2.3 蒙古马躯干部骨骼肌肌纤维类型及肌纤维横截面积分析

本研究在躯干部采集了2匹蒙古马的背最长肌、背阔肌、斜方肌、胸肌、菱形肌共10个肌肉样本(2匹×5个肌肉部位)。由表3可知，蒙古马躯干部骨骼肌的平均快肌纤维占比为37.48%，慢肌纤维占比为62.52%；除菱形肌外其他骨骼肌中慢肌纤维占比更高，骨骼肌肌纤维横截面积的均值为517.66 μm2。其中背最长肌慢肌纤维比例最高(73.75%)；菱形肌慢肌纤维所占比例最小(40.11%)；肌纤维横截面积最大的是快肌纤维占比最大的菱形肌，慢肌纤维占比最大的背最长肌的肌纤维横截面积较小。

表3 蒙古马躯干部骨骼肌肌纤维类型占比及肌纤维横截面积

2.4 蒙古马腹壁侧骨骼肌肌纤维类型及肌纤维横截面积分析

本研究在腹壁侧采集了2匹蒙古马的腹外斜肌、腹内斜肌、胸腹侧锯肌共6个肌肉样本(2匹×3个肌肉部位)。由表4可知，蒙古马腹壁侧骨骼肌的平均快肌纤维占比为43.32%，慢肌纤维占比为56.68%；除胸腹侧锯肌外其他肌肉组织中慢肌纤维占比较高，骨骼肌肌纤维横截面积的均值为580.86 μm2。其中腹外斜肌慢肌纤维比例最高(62.19%)，胸腹侧锯肌的慢肌纤维比例最低(46.54%)；腹外斜肌、腹内斜肌、胸腹侧锯肌其慢肌纤维比例依次递减，但其肌纤维横截面积依次递增。

表4 蒙古马腹壁侧骨骼肌肌纤维类型占比及肌纤维横截面积

2.5 蒙古马后肢骨骼肌肌纤维类型及肌纤维横截面积分析

本研究在后肢采集了2匹蒙古马的比目鱼肌、臀中肌、半膜肌、股二头肌、股阔筋膜张肌、趾长伸肌、股四头肌、腓肠肌共16个肌肉样本(2匹×8个肌肉部位)。由表5可知，蒙古马后肢骨骼肌的平均快肌纤维占比为36.91%，平均慢肌纤维占比为63.09%；除腓肠肌外其他骨骼肌均为慢肌纤维占比较大，骨骼肌肌纤维横截面积的均值为539.94 μm2。其中比目鱼肌慢肌纤维所占比例最大(100.00%)，腓肠肌慢肌纤维所占比例最小(19.08%)；肌纤维横截面积最小的是慢肌纤维占比最大的比目鱼肌，快肌纤维占比最大的腓肠肌的肌纤维横截面积较大。

表5 蒙古马后肢骨骼肌肌纤维类型占比及肌纤维单位横截面积

2.6 蒙古马肌纤维中快慢肌纤维占比与肌纤维横截面积分析

根据免疫组化与HE染色分别得到骨骼肌快慢肌纤维占比、肌纤维横截面积，选取骨骼肌的慢肌纤维占比与肌纤维横截面积，计算其线性相关，从图4中可以看做出：随着骨骼肌中慢肌纤维占比的增加，肌纤维横截面积会减小。这与慢肌纤维较快肌纤维更细这一肌纤维形态结构特点相一致。

图4 蒙古马不同部位骨骼肌慢肌纤维占比与肌纤维横截面积线性相关图

2.7 蒙古马与纯血马肌纤维类型差异显著性分析

根据免疫组化结果，将肌纤维分为快肌纤维和慢肌纤维，如图2所示。对蒙古马与纯血马(MINAKO KAWAI，2009)对应的24块各部位骨骼肌快慢肌纤维占比分为5组进行单因素方差分析，如图5所示。在前肢中蒙古马的慢肌纤维占比与纯血马慢肌纤维占比差异极显著(P<0.001)，在后肢中蒙古马的慢肌纤维占比显著高于纯血马(P<0.05)，躯干部蒙古马的慢肌纤维占比与纯血马慢肌纤维占比差异极显著(P<0.01)，头颈部蒙古马的慢肌纤维占比与纯血马快慢肌纤维占比无显著差异，腹壁侧蒙古马的慢肌纤维占比显著高于纯血马(P<0.05)。蒙古马与纯血马慢肌纤维占比差值如图6所示，蒙古马的慢肌纤维占比基本大于纯血马，除菱形肌外，且菱形肌的快慢肌纤维占比在蒙古马与纯血马上基本一致；其中蒙古马与纯血马在臂三头肌、臀中肌、半膜肌和背最长肌慢肌纤维的差值大于50%。

MH-F.蒙古马前肢；TH-F*.纯血马前肢*； MH-H.蒙古马后肢； TH-H*.纯血马后肢*；MH-T.蒙古马躯干部；TH-T*.纯血马躯干部*；MH-HN.蒙古马头颈部；TH-HN*.纯血马头颈部*；MH-A.蒙古马腹壁侧；TH-A*.纯血马腹壁侧*

图6 蒙古马与纯血马不同部位骨骼肌慢肌纤维差值

3 讨 论

本试验研究了蒙古马全身主要骨骼肌表型，不同部位骨骼肌肌纤维占比不同，可能是不同部位骨骼肌在运动中的作用不同。由统计可知，慢肌纤维占比为后肢、躯干部、头颈部、腹壁侧、前肢依次递减。

头颈部肌肉主要作用是支撑头部重量，在运动时保持身体平衡。夹肌主要使头部后仰和偏头颈，胸头肌是头颈的屈肌[21]。颈部肌肉对马整体运动的速度和耐力影响有限，因此头颈部肌肉组织在不同运动性能马品种之间没有显著差异。

前肢是身体的一部分，指靠近头部或躯干前部的肢体。前肢与后肢相比，前肢的长度较短，身体自然向前倾斜，承受的重量更多，为动物提供了更多的平衡和稳定性，使马在奔跑时更加协调快速，在奔跑时马的一侧前肢在瞬间承载马全部重量，因此前肢主要起到支撑作用[22]。臂三头肌主要作用是伸直肘关节，内收肩关节，用于蹬地和摆动前肢[23]；其慢肌纤维占比更大，运动神经元欠发达，骨骼肌收缩和舒张速度较慢，抗疲劳性强；线粒体数量多，代谢方式以有氧代谢为主，充分消耗糖分且持续提供能量，使臂三头肌拥有更强的耐力。

躯干部肌肉是核心力量的基础，使得前、后肢在运动时更加协调，有效的衔接身体各部位的力量，减少运动带来的损伤[24]。背最长肌是脊柱最长最大的肌肉，主要作用是伸腰背和颈，连接前、后肢，将后肢产生的力量通过背最长肌传导到前肢，推动身体向前运动[25]。背最长肌慢肌纤维占比越高，后肢向前肢传导力量的持续性越好。菱形肌的快慢肌纤维在蒙古马和纯血马中的占比基本一致，猜测菱形肌的快慢肌纤维比例与品种无关。

腹壁侧肌肉与呼吸相关，此部位肌肉收缩影响马的呼吸，从而影响能量代谢和力量的产生,并有助于保持肢体的协调稳定[26-27]。腹外斜肌是吸气肌，腹内斜肌是呼气肌，胸腹侧锯肌拉动肋骨向后协助呼气[28]。当慢肌纤维占比更大时，肌肉的收缩速度减慢，抗疲劳能力更强，使呼吸更深更长，提供更多的氧气，进行有氧代谢，蒙古马较纯血马慢肌纤维占比增大，有氧氧化代谢能力更高，所需氧气更多，符合蒙古马耐力强的特点。

对于马来说，前、后肢所承受的负荷相近，但后肢仍比前肢强壮，马在运动时朝向头的一侧奔跑，后肢承担启动发力的作用，在奔跑和跳跃中尤为重要[29]。后肢的臀中肌是衡量马运动性能的关键肌肉，对抬腿、跳跃、踢腿有很大的作用[30]。由表5可知，蒙古马的臀中肌慢肌纤维占比为71.31%，然而纯血马臀中肌的慢肌纤维只占有13.90%(MINAKO KAWAI，2009)，阿拉伯马慢肌纤维占比为69.60%(Lopez-RiveroJL，1991)[31]。蒙古马臀中肌慢肌纤维占比更加接近于典型的耐力型马种-阿拉伯马。由此推测，蒙古马的耐力性能更好。比目鱼肌是典型的维持姿势的肌肉，比目鱼肌需要好的抗疲劳能力来使得姿势维持的时间更长[32]，需要慢肌纤维占比更高，与本试验结果中的比目鱼肌慢肌纤维占比高相一致。比目鱼肌相对于马后肢肌肉来说是极小的一块肌肉组织，猜测其在运动过程中的作用较小。有研究认为，比目鱼肌可能在本体感受功能方面发挥重要作用[33]。在后肢中，蒙古马的腓肠肌相较于其他肌肉快肌纤维占比更高，运动神经元更大，神经传导速度更快，导致肌肉收缩速度、收缩力量增大；无氧代谢酶的含量更高，无氧代谢能力提高，在短时间内产生更大的能量。腓肠肌起于股骨后端，止于跟骨顶端，主要的作用是弯曲膝关节，伸展踝关节，在蹬地时起到重要作用，使马匹向前推进,在运动中主要提供爆发力，这与腓肠肌快肌纤维占比高相一致[34]。(股)阔筋膜张肌、半膜肌、股二头肌、股四头肌协同完成后肢的运动，在蒙古马身上均为慢肌纤维占比较高，通过影响线粒体含量、酶活性、神经元及骨骼肌收缩使得骨骼肌的耐力更强，后肢作为发力的部位，其骨骼肌慢肌纤维占比大会提高整匹马在运动中的耐力性能。

马匹的运动由骨骼与骨骼肌共同完成。肌纤维可塑性很强[35]。快慢肌纤维在生理功能上有着很大的差异,所以26个部位的骨骼肌快慢肌纤维比例不尽相同。骨骼肌快慢肌纤维占比不是一成不变的，肌纤维类型是逐渐过渡转化的，年龄、饲养、训练调教等因素会使肌纤维类型发生转化[36]。本试验中，蒙古马前肢的冈上肌、臂二头肌、腕桡侧屈肌，后肢的腓肠肌，躯干部的菱形肌、腹壁侧的胸腹侧锯肌的慢肌纤维占比较低。通过外界因素的影响使得肌纤维类型由快肌纤维向慢肌纤维转化的可能性也就越大，当骨骼肌慢肌纤维增多时，骨骼肌中线粒体数量增多，ATP酶的活性提高，有氧氧化能力提高，这使得肌肉在运动中消耗更多的氧气且产生更多的能量，使得运动持续的时间更长，抗疲劳性增强，该骨骼肌在提高耐力方面有更大的潜力。大胆的猜测，对冈上肌、臂二头肌、腕桡侧屈肌、腓肠肌、菱形肌、胸腹侧锯肌进行针对性耐力训练，可以更好的提高蒙古马的耐力。

比较分析了蒙古马与纯血马不同部位肌纤维组成之间的差异，因选取的马匹均为成年健康，未经训练，纯血马所在文章中也已交代，所以这种差异可能与马品种有关，蒙古马人工选育程度低，耐力好[37]。纯血马经过高度人工选育，作为速度型赛马，速度一直作为其选育的最重要目标[38]。因选择条件不同，导致品种之间在基因上存在差异，使得快慢肌纤维占比存在差异。通过免疫组化结果分析，发现蒙古马慢肌纤维占比基本高于纯血马。因此，蒙古马骨骼肌中线粒体的数量更多，线粒体酶活性更强，毛细血管数更多，有氧氧化能力更强，会消耗更多的氧气去产生能量，抗疲劳能力强；蒙古马骨骼肌的运动神经元较小，神经传导速度减慢，骨骼肌收缩速度、力量减小，爆发力较弱，因此蒙古马的耐力更好。蒙古马与纯血马在臂三头肌、臀中肌、半膜肌和背最长肌的慢肌纤维差值较大，造成这一差异的最大因素可能是马品种不同，猜测臂三头肌、臀中肌、半膜肌和背最长肌是影响马匹运动性能的关键肌肉。

马肉品质也与快慢肌纤维的占比有关，在蒙古马全身主要骨骼肌中腕桡侧伸肌、臂三头肌、背最长肌、臀中肌、比目鱼肌的慢肌纤维占比较大(>70%)。肉色是肉品质的关键指标，是消费者对肉的第一印象，虽对肉的食用品质没有直接影响，但是消费者在购买时多会选择颜色鲜红的肌肉[39]。这些骨骼肌以有氧代谢为主，并需要更多的氧气来维持代谢，因此骨骼肌会含有大量的肌红蛋白和毛细血管，使得骨骼肌颜色更加鲜红；骨骼肌的pH直接影响肉品质，屠宰后骨骼肌仍进行代谢活动，骨骼肌以有氧代谢为主，因此通过糖酵解产生的乳酸较少，pH下降的更慢，肉品质会更好[40]。剪切力是衡量肌肉嫩度的重要标准，慢肌纤维占比较大的骨骼肌，其肌纤维的平均直径更细，剪切力更高，骨骼肌的嫩度会更好[41]。比目鱼肌虽然慢肌纤维占比极大，但其体积过小，食用价值低。因此，蒙古马的腕桡侧伸肌、臂三头肌、背最长肌、臀中肌肉质更好。

4 结 论

本研究构建了蒙古马全身主要骨骼肌快慢肌纤维表型谱，其中颈锯肌、冈上肌、臂二头肌、腕桡侧屈肌、腓肠肌、菱形肌、胸腹侧锯肌的慢肌纤维占比较低，具有很高的耐力训练潜力。腕桡侧伸肌、臂三头肌、背最长肌、臀中肌慢肌纤维占比达到70%以上，符合高品质肉的要求，可作为蒙古马肉开发的重点部位。分析蒙古马与纯血马不同部位骨骼肌肌纤维类型占比情况，发现蒙古马慢肌纤维占比基本高于纯血马，前肢、躯干部差异极显著(P<0.01)，后肢、腹壁侧差异显著(P<0.05)，符合耐力型马种特点。臂三头肌、臀中肌、半膜肌和背最长肌在两个马品种中慢肌纤维差值大，猜测其为影响马匹运动性能的关键肌肉，可作为马匹运动性能检测的目标肌肉。