微小残留病灶检测在实体瘤中的应用及进展

杨鑫鑫,孟宏学

肿瘤经过不同方式的治疗后,仍有可能存在部分残留的肿瘤细胞。我们将残留在患者体内,与原发肿瘤表型相似的少量恶性肿瘤细胞称之为微小残留病灶/分子残留病灶(minimal residual disease/molecular residual disease, MRD)。MRD是肿瘤复发的重要原因之一,MRD检测的优势是可以较影像学等传统检查方式更早地发现肿瘤细胞的存在。目前临床上应用较多的MRD检测方法分别为基于循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)。此外,MRD检测也用来对实体瘤患者进行治疗指导、预后评估和动态监测。本文就MRD检测在实体瘤临床诊治发展过程中的应用及进展进行梳理及总结。

1 液体活检技术

液体活检的概念可追溯到1869年CTC的首次提出[1],实际上液体活检并不是实体活检,该术语包括了在体液中可检测到的任何肿瘤衍生成分。所以后续液体活检的概念迅速扩展到了ctDNA和其他肿瘤衍生产物,如外周血游离RNA(circulating cell-free RNA, cfRNA)、细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)、肿瘤诱导血小板(tumor-educated platelets, TEPs)等[2-5]。液体活检在临床上的应用包括早期癌症检测、癌症分期确定、疗效检测、靶向耐药机制检测等,其中基于CTC和ctDNA的检测应用最广泛[6],当前MRD检测应用的主要技术是液体活检技术。虽然目前组织活检是分子病理检测的金标准,但与液体活检相比,它有以下局限性[7],(1)有创性:与血液采集相比,活检术为更有侵入性的有创性检查,同时部分患者由于疾病情况及肿瘤生长部位特殊,并不容易获取肿瘤组织。(2)限制性:当原发肿瘤组织过小或复发转移细胞还未定植前,传统影像学无法检测,从而影响患者的确诊和后续治疗。(3)异质性:同块肿瘤组织不同位置可能会存在空间异质性,例如不同部位所检测出的靶点变异并不相同。(4)时效性:组织无法在患者疾病进展过程中随时获取,而液体活检可起到动态监测的作用。

2 MRD检测技术

2.1 MRD的定义及发展MRD是恶性肿瘤难以根治的主要障碍。尽管肿瘤对许多治疗方式的敏感性均较高,但仍有一些残留的肿瘤细胞持续存在于体内,而目前的影像学检查无法检测和追踪到,最终导致了肿瘤的远处转移和复发[8]。MRD一词起初常用于血液系统恶性肿瘤,通过流式细胞术(检测白血病特异性抗原)或其他分子定量技术,如定量PCR [检测T细胞受体(TCR)或免疫球蛋白(Ig)基因重排]来确定患者治疗后血液中肿瘤细胞的存活状况。除了上文所述的检测CTC外,检测患者血浆中的ctDNA也是一种有效的临床检测方法。因此,基于MRD检测的治疗已常规应用于急性淋巴母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病患者中[9-10]。

目前实体瘤MRD检测技术及临床研究取得飞速进展,显著降低了多种肿瘤的发病率和病死率[11]。基于CTC或ctDNA的液体活检检测为多种实体瘤患者检测MRD的主要方式,其中临床上以基于ctDNA的MRD检测更为常见。

2.2 MRD的发生机制肿瘤难以治愈的解释之一是放化疗对实体瘤细胞造成的损伤是随机分布的,这就无法保证每个肿瘤细胞都得到了有效的消灭,总有部分肿瘤细胞受到的损伤较小从而导致这部分肿瘤细胞的再生,即出现MRD。目前已有部分研究提出了肿瘤细胞反复在药物敏感性肿瘤中存活的机制,除了肿瘤细胞自身内部的机制外,肿瘤微环境的变化,如来自成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质及血管网络等的信号也发挥了一定作用[8]。

2.2.1肿瘤细胞内部机制 (1)肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)对治疗耐受性更强:肿瘤的生长依赖于一些能够自我更新的CSC,而另外大部分肿瘤细胞由快速增殖的细胞和有丝分裂后的分化细胞组成,这些细胞不能自己形成肿瘤。关于MRD,CSC方面的研究认为CSC对放疗及药物治疗的耐受性更强,从而导致了患者初始治疗后的肿瘤局部复发和远处转移[12-13]。(2)残留的肿瘤细胞增殖速率加强:有研究观察到,在放化疗期间肿瘤细胞的再生速率随时间递增。在患者初始治疗后,后续的治疗周期中肿瘤细胞将加速再生最终导致肿瘤复发[14]。(3)残留的细胞表现出代谢特性同时依赖自噬来生存:残留的肿瘤细胞表现出了独特的代谢特性,如细胞糖酵解更少,更依赖线粒体途径产生能量等;同时细胞自噬和微脂自噬对这些残留细胞的生存起到了至关重要的作用[15]。(4)多倍体残留肿瘤细胞更易复发:部分残留细胞通过暂停肿瘤细胞的有丝分裂活性,同时维持DNA的复制从而进入细胞周期阻滞来导致复发。有丝分裂中DNA的解偶是p53缺陷细胞的一个重要特征[16]。(5)残留的肿瘤细胞或许经历了染色质介导的可逆性耐药状态:对持续性耐药细胞(drug-tolerant persisters, DTPs)的基因表达分析揭示了几个参与染色质修饰基因的改变。值得注意的是,组蛋白H3K去甲基化酶KDM5A/Jarid1A的基因表达增加,其表达缺失减少了DTPs的数量[17]。

2.2.2肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的影响 (1)TME分泌的因子影响肿瘤的生长和耐药性:肿瘤细胞和TME中的细胞之间存在相互作用,从而影响肿瘤细胞对凋亡的敏感性及对化疗的反应。有研究发现肿瘤基质细胞分泌的肝细胞生长因子可保护邻近的肿瘤细胞不被药物损伤[18]。(2)TME中的免疫细胞影响肿瘤的生长:肿瘤浸润性免疫细胞在控制肿瘤生长中起重要作用,肿瘤免疫编辑的概念描述了免疫系统对肿瘤生长的影响[19]。(3)肿瘤血管化:肿瘤细胞和血管之间距离的变化可能是影响肿瘤内治疗异质性的另一个重要因素。有研究表明靠近血管系统的肿瘤细胞较远处的肿瘤细胞更容易被化疗药物损伤和消灭[20]。

3 MRD评估技术

3.1 基于CTC的评估

3.1.1CTC的富集 CTC利用肿瘤细胞和血细胞之间的差异性来实现高效富集,包括细胞表面蛋白的差异表达和细胞其他的不同物理特性等。在标志物方面,上皮细胞黏附分子(EPCAM)是CTC中应用最广泛、用以进行阳性选择的细胞表面蛋白[21]。此外,其他上皮细胞表面抗原如EGFR、mucin 1、组织特异性抗原(包括前列腺癌细胞特异性膜抗原PSMA、乳腺癌特异性抗原HER2)都可以在CTC中对某类具有特定特征的肿瘤细胞进行富集[22-26]。

CTC富集的非标记性技术是基于肿瘤细胞和非恶性血细胞的大小、密度、电荷和变形能力之间的物理差异[27]。这些特征在CTC之间差异很大,可能会存在一些细胞重叠。CTC的大小定义取决于例如微过滤器的捕获装置,研究显示大多数血细胞的直径约为10 μm,而CTC的直径变化较大,大多数为6～20 μm[28]。目前微过滤技术已逐步发展成熟,其原理是将血液通过微孔或微流控步骤,对尺寸进行校准后进行捕获[29]。

3.1.2CTC的检测 CTC富集后其内部可能仍包含数百到数千个白细胞,所以后期需要使用特定的可靠方法来识别单个的CTC。CTC可以采用一系列的方法来识别,主要方法是使用针对细胞膜和细胞质抗原的抗体直接进行免疫检测,包括上皮、间充质、组织特异性和肿瘤特异性相关标志物,例如PSMA、HER2等。同时应用CD45排除白细胞,后续可通过手动操作分离已识别出的CTC[30]。上述方法操作相对较为繁琐,后续可应用另一种方法分离CTC用于进一步基因组、分子或功能分析。这种方法应用DEPArray进行自动单细胞选择,这是一种能够在DEP中捕获单个CTC的设备[31-32]。目前一种新的荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting, FACS)方法也被用于CTC检测和表型分析,但这种技术通常需要一个预富集步骤,以达到足够高的起始CTC浓度[33]。

CTC还可以通过基于核酸的原理来识别。在mRNA或DNA水平上检测CTC需要通过使用引物来检测组织特异性、器官特异性或肿瘤特异性的转录本,以及肿瘤特有的基因突变、易位或甲基化模式等。后续可使用RT-qPCR检测低丰度的mRNA转录本,以此来定量CTC[34]。

一些功能分析方法,如上皮免疫位点(EPISPOT)也被开发应用于CTC的检测。利用这项技术,可以根据荧光检测从这些细胞分泌、脱落或以其他方式释放的特定上皮蛋白来评估短期细胞培养物中存活CTC的存在(如CK19、PSA)[35]。该方法提供了样本中存活CTC的定量信息,以及细胞培养过程中蛋白质分泌或脱落的定性信息。同时这种检测方法逐步发展成了敏感性液体微滴(EPIDROP)检测,该种方法可以在单细胞水平上捕获和检测CTC[36]。使用这种方法可以对CTC进行染色,以确定CTC的总数(EPCAM+或EPCAM-)以及功能性CTC的数量[27]。

3.2 基于ctDNA的评估

3.2.1ctDNA的富集 近些年ctDNA用于临床实体瘤患者MRD的检测越来越普遍,相关基础与临床研究也层出不穷。其原理是肿瘤会将DNA释放到血液中,通过患者常规采血后的血浆分离出ctDNA。虽然ctDNA只代表血浆中cfDNA的一小部分,但它可以通过PCR或二代测序(next generation sequencing, NGS)等方式进行扩增后检测,然后针对肿瘤特异性突变、结构变异、拷贝数变异和表观遗传学特征进行分析[37-38]。

在基于ctDNA的MRD检测中常以平均肿瘤分子数(mean tumor molecules, MTM)和等位基因变异频率(variant allele frequency, VAF)来量化肿瘤的特异性变异。VAF测量了变异等位基因与野生型等位基因的比例,MTM检测了细胞中游离DNA的总量[7]。当前大多数基于ctDNA的MRD检测平台均以上述两种方式中的一种来评估ctDNA数量。有研究分析了来自3 000多例患者的6 000余份血浆样本,以评估VAF和MTM在多种实体肿瘤不同环境中的平均肿瘤负荷相关性。除去cfDNA水平较高(≥50 ng/mL)的情况外,VAF和MTM之间呈显著正相关。随着MTM的增加,VAF值趋于稳定,这种情况可能是VAF在cfDNA高水平患者中的检测局限性。同时,MTM在接受免疫治疗的晚期实体瘤患者中较VAF有更强的预后相关性[39]。

3.2.2ctDNA的检测 ctDNA的检测方法包括,(1)PCR:应用PCR将目标基因或位点进行扩增后进行相关分析。(2)数字PCR(digital PCR, dPCR):dPCR改进了传统的等位基因特异性PCR扩增,将DNA样本划分为较小的反应,特点是能够提供一个绝对的定量,提高了反应的敏感性[40]。(3)NGS:可分为扩增法NGS和捕获法NGS,已应用于几种不同的ctDNA分析方法,无论是哪种方式的NGS都可以从一个生物样本中检测到数百万至数十亿的DNA分子[41-42]。(4)全基因组测序:理论上将全基因组测序(WGS)应用于血浆中ctDNA检测可以比NGS方法检测到更多的突变,同时不需要进行panel选择,但存在背景错误率高,追踪突变数量过多、性价比不高等缺点[43]。(5)新兴技术:一些基于DNA甲基化或其他反映肿瘤细胞染色质状态的表观遗传特征的分析方法(片段组学)已被用于检测ctDNA[44]。

基于ctDNA的MRD检测技术方法可分为两种,分别是肿瘤知情检测(tumor-informed assays)和肿瘤未知检测(tumor-agnostic assays)。前者是对患者原发肿瘤进行监测后,根据患者自身情况个性化定制panel进行后续的监测,后者是将既往与相关肿瘤相关的基因组成固定panel进行检测。

在患者有手术及治疗的情况下,治疗后进行ctDNA检测的周期十分关键,需在手术后2～4周进行检测。这是因为手术后可能导致患者正常的循环cfDNA水平升高,导致检测的背景噪声增强。这种情况会稀释ctDNA,降低检测的敏感性。同时建议对手术前4周内检测不到ctDNA的患者进行重复检测,以避免假阴性[45-46]。此外,在患者全身治疗过程中,ctDNA水平会迅速下降。理想情况下,MRD评估应在辅助化疗开始之前,而不是在全身治疗期间。在进行动态监测的情况下,对辅助治疗结束后2～4周再进行基于ctDNA的MRD评估才更合理[7]。国内《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》推荐MRD首次检测时间窗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)根治性治疗1周～1个月;早期NSCLC患者根治性切除术后,MRD阳性提示复发风险高,需进行密切随访管理,建议每3～6个月进行1次MRD检测[47]。

4 MRD在肿瘤进展中的作用

4.1 早期肿瘤高危人群分层在早期肿瘤患者人群中,部分患者经过根治治疗可以达到治愈的目的,但还有许多患者体内会携带MRD。此时MRD检测可以辅助对这部分早期患者进行分层。对于检测后提示无MRD的患者只需接受定期随访,而针对手术/放化疗等手段后仍检测出MRD的患者应进行相应治疗策略的调整[48]。该种方式可以为治愈的早期肿瘤患者减少治疗负担,筛选出高复发风险、最能从辅助治疗中获益的早期肿瘤患者,避免过度诊疗,节省医疗资源。

4.2 疗效预测及治疗指导LUNGCA-1研究为大规模前瞻性、多中心队列研究,研究纳入了不同分期的NSCLC患者。在对这些患者的术前血样检测发现,术前ctDNA检测MRD阳性患者中有46.4%出现了术后复发,而术前ctDNA检测MRD阴性患者中仅有14.6%复发[49]。这种现象也提示我们患者术前MRD检测可以对治疗疗效进行一定的预测。同时在患者治疗期间,ctDNA的变化也能反映出患者对治疗的敏感度,当患者MRD持续升高要考虑治疗方式的选择是否出现问题,是否需要更换治疗方法等[50]。

4.3 预后判断及复发监测MRD检测相比于传统检测(影像学/肿瘤标志物)的最大优势就是更早的检测出肿瘤细胞阳性,从而预测复发。同时血液/体液样本相对于组织学样本更易获取,创伤性较小,可以在患者治疗后的一段时间内进行动态检测,以提示患者复发风险程度。术后辅助治疗后ctDNA持续阴性或下降至阴性并持续为0则提示患者复发风险较低;术后辅助治疗后ctDNA先降后升或停止治疗后迅速上升则提示患者出现耐受,需更换治疗方式;术后ctDNA为阴性,在未接受治疗的情况下逐步上升则提示患者出现MRD,存在复发风险[47]。

5 MRD在肿瘤诊断中的作用

近些年MRD检测技术已逐渐应用于多个实体瘤中,关于MRD的临床研究也展示了许多十分重要的成果。目前基于CTC和ctDNA的MRD检测技术已应用于乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、结直肠癌和肺癌等。

5.1 肺癌有研究针对接受化疗的晚期NSCLC人群进行基于CTC的MRD检测(某些患者需行姑息放疗)。研究包含了70例Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者,这部分患者在1个周期化疗后进行检测。结果发现在7.5 mL血液中检测到>5个CTC的患者预后明显差于<5个CTC的患者[51]。在基于ctDNA的MRD检测研究中也发现,MRD持续阴性患者的长期临床结局较好,复发率较低。同时该研究还显示在患者术后12～18个月内MRD阳性及复发风险达到了高峰[52]。

5.2 结直肠癌一项单中心研究针对183例非转移性结直肠癌患者进行了CTC的前瞻性随访评估,从初始诊断起中位随访时间5.1年。在对30 mL血液分析后显示,44例患者(24%)在术前检测出CTC,且CTC阳性与不良结局相关[53]。另有研究应用基于ctDNA的NGS方法对230例Ⅱ期结肠癌患者的1 046份血浆样本进行了MRD前瞻性分析。在178例未接受辅助化疗的患者中,14例(7.9%)患者术后检测到ctDNA。中位随访时间27个月,ctDNA阳性患者的复发率高于ctDNA阴性患者[54]。

5.3 乳腺癌有研究证明诊断为乳腺癌后5年左右患者存在CTC可能预示着HER2阴性乳腺癌的复发。在353例激素受体阳性乳腺癌患者中,CTC阳性组的复发率为21.4%,而CTC阴性组的复发率仅为2.0%。多变量分析表明,CTC阳性预示着复发风险将增加13.1倍[55]。另有研究应用134个癌症相关基因组成的Panel来评估ctDNA作为MRD生物标志物的适用性。在新辅助化疗后存在MRD的38例三阴型乳腺癌患者中,33例原发肿瘤中发现了至少1个突变。有4例患者在辅助治疗期间的cfDNA样本中检测到突变,且这4例患者在9个月内病情出现了复发[56],虽然样本量较小、但也可以说明基于ctDNA的MRD检测与乳腺癌患者的复发密切相关。

6 总结

在过去10年里,MRD检测为肿瘤诊断开辟了新的途径,为个性化治疗提供了重要的临床线索。同时基于CTC和ctDNA的MRD评估为患者肿瘤隐匿阶段的MRD检测提供了更可靠的依据。目前越来越多的实体瘤MRD临床试验投入到研究中,我们期待这些试验能够解决更多临床场景中所面临的实际问题。在未来MRD检测也面临着诸多挑战,例如更多检测方式的选择、检测方法的特异性和敏感性等。同时MRD的标准化、质量控制方案以及相应的实验室认证也将是其应用转化为临床常规的主要挑战。