西藏土壤芽孢杆菌的分离鉴定及生防促生菌筛选

董晓雪 彭国袁 常卓凡 于文娟 旺姆

摘要：青稞是西藏人民的主要粮食作物，在种植生长过程中有多种病害对其产生危害，直接影响青稞的产量和质量。本研究针对如何绿色防治西藏青稞网斑病立题，以期找到对某一种或几种青稞病害高效的生防菌株，为青稞网斑病防治及生产实际提供材料。采集林芝市鲁朗镇扎西岗村的青稞网斑病植株活体样本，采用组织分离法和离体培养法获得青稞网斑菌菌株XZQKWB。从西藏自治区不同采样点采集根际土壤，采用温度筛选法和平板涂布法分离得到11 718株芽孢杆菌。以分离得到的芽孢杆菌为材料，以6种病原菌为靶标，共筛选得到 14 株对 6 种病原菌均具有不同程度的抑制效果的芽孢杆菌：91-5、92-1、92-10、92-3、27-36、32-69、94-19、44-36、5-142、58-59、58-7、59-60、63-35和 66-53。结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析，初步鉴定 58-7、59-60、27-36、63-35、44-36、58-59 和66-53 为阿氏芽孢杆菌（Priestia aryabhattai）；菌株 94-19 和 32-69 为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）；菌株 92-10 和 92-3 为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）；菌株 91-5 为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）；菌株 92-1和 5-142 为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对14株菌进行生防盆栽和促生盆栽试验，结果表明菌株 92-10 兼具溶无机磷能力、解钾能力、固氮能力等促生特性，对藏青 2000 种子的根长、芽长、株高、地上部鲜质量都有明显的促生效果，在平皿对峙试验中对6个病原菌的抑制率均达到50%以上，在青稞网斑病的盆栽防治试验中防效达到 76.5%。

关键词：芽孢杆菌；分离；鉴定；生防促生；青稞网斑病

中图分类号：S182  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）23-0114-10

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因成熟时籽粒裸露别称裸大麦，主要分布在青海、西藏以及甘肃等高海拔地区，其中以西藏种植范围最广［1］。公元5世纪以来，青稞是藏族同胞的主粮，在青藏高原被广泛种植，不仅为藏区的粮食安全提供了重要保障，而且为酿造行业提供了优良原料，其中青稞酒和青稞啤酒深受人们的喜爱［2］。 青稞网斑病是西藏自治区青稞种植上最常见的重要病害之一，是一种分布广且危害重的种传病害，发病严重时植株死亡率可达 9%～40%，严重影响产量和品质［3］。青稞网斑病病原菌为子囊菌亚门、核腔菌属，无性时期为半知菌亚门、长蠕孢属的大麦网斑内脐蠕孢［Drechslera teres （Sacc.） Shoem.］，有性态为子囊菌纲、盘菌目、盘菌科、核腔菌属的圆核腔菌［Pyrenophora teres （Died.） Drechler］［4］。目前青稞网斑病的防治方法仍以使用化学试剂为主，但长期使用化学试剂会影响青稞的品质，并且对人畜和生态环境也有巨大的威胁。生防菌绿色、安全且无公害，可以改善作物环境，调节土壤的理化性质，具有很大的发展潜力。生物防治是一种环境友好型策略，经过多年来科研工作者的共同努力，筛选到了大量菌株，近年来用于防治植物病害的生防菌中芽孢杆菌是应用最广泛的菌种之一，芽孢杆菌繁殖快、抗逆性强、生物安全性高，可以通过拮抗作用、竞争作用及诱导植物产生抗性等机制防治植物病害病原菌。多个试验研究表明，芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）可以防治各类作物病害，是重要的生防菌来源［5-9］。芽孢杆菌作为一种非致病细菌，安全、绿色，可以高效拮抗病原微生物。本研究从西藏不同生态区根际土壤中筛选能抑制青稞网斑病和小麦赤霉病的拮抗细菌及能溶磷、解钾固氮、产吲哚-3-乙酸（IAA）的促生细菌，研究其防病促生效果，以期为青稞生产上的病害防控以及产量提高提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

试验时间为2021年12月至2023年3月。试验地点为西藏农牧学院植物科学学院植物病理与微生物实验室。

1.2 供试材料

1.2.1 供试土壤 采自西藏自治区不同生态区的根际土壤。

1.2.2 供试病原真菌 青稞网斑病菌［Pyrenophora teres （Died.） Drechler］从采集的病部样本中分离。禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum）、黄瓜立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）、亚洲镰刀菌（F. asiaticum），由西藏農牧学院植物病理与微生物实验室提供。

1.2.3 供试培养基

试验主要培养基有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、羧甲基纤维素钠（CMC）培养基、LB培养基、无机磷培养基、亚力山德罗夫培养基、Ashby培养基、King 氏液体培养基［10-16］。

1.2.4 供试青稞种子 试验用青稞种子为藏青2000。

1.3 青稞网斑病病原菌的分离鉴定

1.3.1 分离

青稞网斑病病株材料选自西藏自治区林芝市鲁朗镇扎西岗村（94°74′E，29°74′N），海拔 3 373 m。采用组织分离法分离青稞网斑病病原菌，将处理好的叶片放在 PDA 培养基中，用封口膜封好，在25 ℃培养箱中培养7 d。用接种针挑取边缘部位，接种到新的PDA培养基中，共纯化3次。纯化后用5 mm打孔器打孔，将菌饼倒置于空白的PDA培养基中，培养7 d。

1.3.2 鉴定

在显微镜下观察病原菌的孢子及菌丝形态，并将 PCR 产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行后续ITS鉴定。将测定序列在 NCBI 网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性比较（BLAST），选取其中与之同源性较高的细菌ITS序列，利用 MEGA软件进行序列对比及剪裁，用NJ（neighbor-joining）法构建系统发育树。

1.4 西藏土样芽孢杆菌的分离、纯化及保藏

本试验自西藏自治区不同生态区采集到97份根际土壤，采用平板涂布法，对土壤里的芽孢杆菌进行分离及纯化，得到11 718株菌，对分离得到的菌株进行保藏。

1.5 生防芽孢杆菌的筛选

采用平板对峙法分别测定所有菌株对青稞网斑病菌、禾谷镰刀菌、苹果腐烂病菌、辣椒枯萎病菌、黄瓜立枯丝核菌、亚洲镰刀菌的抑菌活性。

1.5.1 初筛

用5 mm打孔器在病原菌的平板上打孔制成菌饼，再用接种针挑取菌饼接种于PDA平板中央，将待测芽孢杆菌等距接于病原菌的四周，四周的芽孢杆菌为不同的菌株，将接种好的平板培养基用封口膜封口并倒扣置于25 ℃恒温培养箱培养4～7 d后观察。筛选对指示菌有明显抑菌活性（抑菌带或抑菌圈）的菌株。

1.5.2 复筛

采用平板对峙的方式，用接种针挑取 PDA 平板的病原菌菌饼，倒置接种于 PDA 培养基中央，用直径 5 mm 无菌打孔器将病原菌制成菌饼，再用接种针挑取菌饼接种于PDA 平板中央，将待测芽孢杆菌等距接于病原菌的四周，对初筛入选的每个芽孢杆菌形成1组，每组重复 3 次，在 25 ℃恒温培养箱继续培养 3 d。用十字交叉法测量抑菌圈的直径，列表记录。抑菌率=（对照真菌菌落直径-处理真菌菌落直径）/对照真菌菌落直径×100%。将抑菌率数据列表记录。

1.6 生防芽孢杆菌的鉴定

1.6.1 形态学鉴定

将筛选得到的14株具有拮抗效果的菌株接种于LB固体培养基上，培养48 h后观察菌落的形态特征，确定菌株的形态，进行革兰氏染色后观察菌株细胞的形态及产孢情况［17］。

1.6.2 生理生化特征

参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法对14株菌株进行接触酶试验、V-P试验、甲基红试验、脲酶水解试验、淀粉水解试验、吲哚试验、糖醇类发酵试验（葡萄糖、甘露醇、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、肌醇）［18］。

1.6.3 分子生物学鉴定

将14株菌株的平板送至北京擎科生物科技股份有限公司进行16S rDNA鉴定，将测定序列在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性比较（BLAST），选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，利用MEGA软件进行序列对比及剪裁，用NJ法构建系统发育树。

1.7 芽孢杆菌的促生效果验证

1.7.1 溶无机磷能力的测定

将无机磷培养基制成平板，将菌株点接于平板的四周，设置不加菌株的空白培养基为对照，在 28 ℃培养 5～7 d 后观测溶磷效果［19］。采用十字交叉法测量溶磷圈直径（D）及菌落直径（d），D/d的数值越大，说明溶无机磷磷效果越好。

1.7.2 解钾能力的测定

将亚历山德罗夫培养基制成平板，将菌株点接于平板四周，设置不加菌株空白培养基为对照，在 28 ℃培养 5～7 d 后观测解钾效果［20］。采用十字交叉法测量解钾圈直径（D）及菌落直径（d），D/d数值越大，说明解钾效果越好。

1.7.3 固氮能力的测定

采用划线接种的方法，将菌株划线于Ashby固体培养基上，在30 ℃培养 10 d，连续转接3次，第3次依然能在Ashby培养基上生长的细菌则被视为具有固氮能力［21］。

1.7.4 产IAA能力的测定

将14株菌株接种到LB液体培养基中，置于28 ℃且180 r/min的摇床培养24 h，取菌悬液测D600 nm为 0.5 左右。将菌悬液接种到含100 mg/L的King氏液体培养基中和不含色氨酸的King氏液体培养基中，设置空白的无菌水作为对照组，置于28 ℃且180 r/min的摇床培养 5 d。取一定量的菌悬液加入等量的PC比色液或S2比色液滴在白瓷版上，观察颜色变化，颜色变粉或变红，说明具有产IAA能力，颜色越红代表产 IAA 能力越强［22］。

1.7.5 促生功能验证

将14株菌株接种到LB液体培养基中，置于28 ℃且180 r/min的摇床培养 24 h，取菌悬液稀释50、500倍。提前将种子用75%乙醇和5%次氯酸钠进行消毒处理，然后将种子分别用14株菌株的50、500倍菌悬液浸种2 h，对照组用清水浸种2 h，随后分别整齐摆放在灭菌的培养皿中。用于平皿试验的种子，每个处理3次重复，每次重复10粒青稞种子，设置清水对照，加入适量无菌水放入25 ℃恒温培养箱培养7 d，测量其芽长和根长。用于促生盆栽的种子，放入适量无菌水催芽 12 h。每個处理3次重复，每次重复10粒青稞种子，设置清水对照。

1.8 芽孢杆菌的生防效果验证

将培养7 d的青稞网斑病病原菌菌株和小麦赤霉病病原菌菌株接种到灭菌的CMC培养基中，25 ℃、200 r/min条件下培养5～7 d后用纱布过滤得到孢子悬液，用血球计数板计数，然后配制成浓度为106 CFU/mL的孢子悬液。将14株菌株接种到LB液体培养基中，置于28 ℃且180 r/min的摇床培养24 h，取菌悬液稀释50、500倍。提前将种子用75%乙醇和5%次氯酸钠进行消毒处理，然后将种子分别用14株菌株的50、500倍菌悬液浸种 2 h，对照组用清水浸种2 h，随后在青稞网斑病菌孢子悬浮液中浸种30 min，放入适量无菌水催芽 12 h。每个处理3次重复，每次重复10粒青稞种子，设置清水对照。青稞网斑病防治盆栽培养7 d后，按严重度分级标准计算各处理与对照的病情指数及防效［23］。

2 结果与分析

2.1 青稞网斑病病原菌的分离及鉴定

对分离得到的青稞网斑病病原菌XZQKWB的菌落形态进行观察，可以看出菌落中间为墨绿色，大体呈灰色，圆形，絮状，微微凸起于培养基的表面（图1）。将该菌株的ITS序列在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性比较（BLAST），选取其中与之同源性较高的真菌ITS rDNA 序列，利用MEGA软件进行序列对比及剪裁，用NJ法构建系统发育树。发现该菌的ITS与圆核腔菌（Pyrenophora teres）高度相似，达99%以上，其中与Pyrenophora teres isolate 98-2a的同源性达100%（图2）。

2.2 生防芽孢杆菌的筛选

初筛获得825 株菌株能对6种靶标病原菌具有不同程度的抑制作用，其中大部分菌株的抑制率为10%～20%，有56株菌株对部分病原菌的抑制率可达到50%及以上。采用平板对峙法，对初筛入选的56株菌株进行复筛，筛选出具有较好拮抗效果的菌株14株，14株菌株对6种靶标病原菌的抑制率如表1所示。

2.3 生防芽孢杆菌的鉴定

2.3.1 形态鉴定

将菌株接种于LB培养基上，25 ℃ 恒温培养48 h后，观察平板中的菌落形态，菌株的颜色为白色和褐色，形状多为圆形，表面多为光滑、湿润、不平坦和不透明，边缘整齊或不整齐（表2）。

2.3.2 生理生化试验 14株菌株的革兰氏染色试验结果表明，14株菌株均为阳性，个体形态多为杆状，单个或成链状。14株菌株的生理生化试验结果如表3所示。

2.3.3 分子生物学鉴定

将筛选得到的具有拮抗效果的 14株菌株进行 16S rDNA 序列测定，并在 NCBI 数据库进行 BLAST同源性比对，比对结果如图3 所示。

结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析， 推断 58-7、59-60、27-36、63-35、44-36、58-59和66-53为阿氏芽孢杆菌；菌株94-19和32-69为沙福芽孢杆菌；菌株 92-10和92-3为萎缩芽孢杆菌；菌株 91-5 为贝莱斯芽孢杆菌；菌株92-1和5-142为枯草芽孢杆菌。

2.4 芽孢杆菌的促生效果验证

2.4.1 溶无机磷能力的测定

由表4可知，对14株芽孢杆菌进行溶无机磷能力测定，结果表明14株菌株均具有溶无机磷能力，能力最强的菌株是32-69、44-36和27-36。

2.4.2 解钾能力的测定

由表5可知，对14株芽孢杆菌进行解钾能力测定，结果表明，12株菌株具有解钾能力，能力最强的2个菌株是44-36和 63-35。

2.4.3 固氮能力的测定

对14株芽孢杆菌进行固氮能力测定，结果（图4）表明，14株菌株均具有固氮能力。

2.4.4 产IAA能力的测定

由图5、表6可知，对14株芽孢杆菌进行产IAA能力测定，结果表明，13株菌株具有产IAA能力。

2.4.5 平皿试验

由表7可知，处理过的植株与对照组相比具有显著差异。从芽长和根长方面来看，经过50倍菌液处理过的种子在平皿上的生长情况比对照组的生长情况相对较好。从根长方面来看，处理组的植株与对比组的植株存在显著差异，菌株

63-35、27-36、92-10 菌液处理过的植株根长促生效果较好；从芽长方面来说，菌株92-10、92-1 和92-3菌液处理过的植株芽长促生效果较好。

从芽长和根长方面来看，经过500倍菌液处理过的种子在平皿上的生长情况比对照组的生长情况相对较好。从根长方面来看，处理组的植株与对照组的植株存在显著差异，菌株63-35、44-36、94-19 菌液处理过的植株芽长促生效果较好；从芽长方面来说，菌株44-36、94-19、63-65菌液处理过的植株芽长促生效果较好。

2.4.6 促生盆栽

由表8可知，50倍菌液处理过的植株与对照组相比具有显著差异。从根长方面来看，处理组植株与对照组植株差异不显著；从株高方面来说，菌株 58-7、92-1、91-5菌液处理过的植株株高促生效果较好。从地上部鲜质量方面来看，菌株92-3、58-59、59-60菌液处理过的植株地上部鲜质量促生效果较好；从地上部干质量方面来说，经过菌株92-3、58-59和59-60菌液处理过的植株地上部干质量促生效果较好。从地下部鲜质量方面来看，处理组植株与对照组植株差异不显著，经过菌株27-36菌液处理的种子生长情况相较对照组种子生长情况较差，经过菌株92-3、59-60、63-35菌液处理过的植株地下部鲜质量促生效果较好；从地下部干质量方面来说，菌株58-59、59-60和92-3 菌液处理过的植株地下部干质量促生效果较好。

由表9可知，500倍菌液处理过的植株与对照组相比，差异不显著。

2.4.7 生防盆栽 由表10可知，50倍菌液处理对青稞网斑的防治试验，菌株92-10的病情指数为20.99，相对防效为76.50%；菌株58-59的病情指数为22.51，相对防效为74.79；菌株94-19的病情指数为34.61，相对防效为61.24%。500倍菌液处理对青稞网斑的防治试验，菌株58-59的病情指数为25.40，相对防效为71.56%；菌株94-19的病情指数为28.33，相对防效为68.27；菌株59-60的病情指数为33.34，相对防效为62.67%。

3 讨论

Bhattacharyya等的研究表明，茶树根际土壤的阿氏芽孢杆菌 AB211可溶解无机磷酸盐，合成铁载体，并具有产IAA能力［24］。阿氏芽孢杆菌菌株 59-60、27-36、63-35、44-36、58-59和66-53均兼具融磷、解钾、固氮和产IAA能力，且对青稞具有一定的促生效果，对青稞网斑病具有较好的防治效果。Rong等研究表明，从桂花中分离出的沙福芽孢杆菌对水稻稻瘟病有生防潜力［25］。本研究中沙福芽孢杆菌菌株94-19兼具溶磷、固氮和产IAA能力，菌株32-69兼具溶磷、解钾、固氮和产IAA能力，菌株94-19和菌株32-69对青稞的根长、芽长、株高均具有良好的促生效果，且对青稞网斑病的防治效果达到68.27%和47.74%。刘欣等从草原土样中分离得到1株萎缩芽孢杆菌DM3-18，对苹果树腐烂病的防治效果高达77%以上且对其他 9 种病原菌均具有一定的拮抗效果［26］。本研究中萎缩芽孢杆菌菌株92-10兼具溶磷、解钾和固氮能力，菌株92-3兼具溶磷、解钾、固氮和产IAA能力，2个菌株对根长、株高都具有较好的促生效果，且对青稞网斑病的防治效果达到76.5%、50.65%。刘子瑶等从人参根部分离得到贝莱斯芽孢杆菌 LXS-N2，对人参立枯病病原菌和人参猝倒病病原菌的抑菌率达到70.27%、78.30%，具有较好的生防潜力［27］。本研究中贝莱斯芽孢杆菌91-5兼具溶磷、解钾、固氮和产IAA能力，对青稞的芽长、根长和株高具有一定的促生效果，对青稞网斑病的防效为42.40%。敖远等对枯草芽孢杆菌262XY2的试验表明，0.5%菌肥处理对番茄促生效果最好［28］。

祖雪等从健康叶片中分离得到枯草芽孢杆菌K-268，对稻瘟病病菌的抑制率为86.30%，对稻瘟病的防效达到60.23%［29］。本研究中枯草芽孢杆菌菌株92-1和5-142兼具溶磷、解钾、固氮和产IAA能力，对青稞具有一定的促生效果，对青稞网斑病的盆栽防效为58.34% 和45.85%。

由于土壤中分離得到的芽孢杆菌属在生物防治以及植株促生方面的研究越来越多，寻找新的具有生防潜力和促生潜力的菌株并对其开发利用是近几年的热点之一。本研究采集了不同生境的土壤，对其中的芽孢杆菌进行研究，筛选得到具有生防和促生功能的菌株，对青稞的种植以及生物防治具有重要的意义。但试验只做到了室内盆栽部分，还没有进行大田试验验证，前人研究中生防菌株都存在平皿试验和室内盆栽试验效果较好，但在大田试验中防效较差，且促生效果也较差，存在抑菌效果不稳定的缺陷。

总之，分离筛选得到的菌株具有一定的生防潜力，不仅为青稞网斑病的防治研究提供了一定的基础，对其他病害的防治也有一定的参考效果。

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