外泌体在多发性硬化中的研究进展

张梦洁,张 磊,秦新月,冯金洲

(重庆医科大学附属第一医院 a.神经内科,b.康复医学科,重庆 400016)

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种病因未明的中枢神经系统炎性自身免疫性脱髓鞘疾病,主要累及脑、脊髓和视神经。其主要病理改变包括中枢神经系统白质脱髓鞘、炎性浸润和轴突破坏等。外泌体是一种细胞外分泌的多囊泡体,内含细胞的生物分子,如蛋白质、脂质、DNA和RNA等多种成分,释放到细胞外后,通过多种方式影响受体细胞,包括细胞融合、与受体细胞表面受体的相互作用,以及被受体细胞摄取等,发挥各种生物学功能如抗原呈递、免疫调节和组织修复等。近年来研究证实外泌体参与MS的多个生理病理改变过程。外泌体不仅参与MS的生理病理改变,而且可以用于预估疾病进展、作为MS的诊断手段和治疗方法。本文就外泌体对MS的发病机制及其在MS的诊断和治疗中的潜在作用进行综述探讨。

1 外泌体的生物学功能

外泌体属于胞外囊泡的一种,是含有胞浆质膜的、直径在30～120 nm的微小囊泡。它主要是细胞内的溶酶体内陷后,形成多囊泡体,当受到刺激(如低氧、氧化应激等)时,多囊泡体释放到细胞外,形成外泌体[1,2]。它在大部分体液中均能检测到,如血清、脑脊液、尿液、乳汁、唾液、羊水等[3]。外泌体作为一种细胞之间的信息传递介质,可以在细胞与细胞之间交换胞膜蛋白和胞浆,激活受体及下游通路等,发挥不同的生物学功能[4,5]。根据外泌体的细胞来源和靶向功能不同,外泌体中会含有不同的物质,包括脂质、蛋白质、DNA、miRNA、mRNA、非编码RNA以及来自病毒或朊病毒的遗传物质[6],并介导不同生物学功能,包括免疫反应、细胞分化和细胞凋亡的调节等[7]。同时,外泌体表面也含有多种生物标志物,一些是共有的,如CD9,CD63,CD81、Alix、热休克蛋白70、MHCⅠ等[3,8～10];另一部分生物标志物则依赖于其来源的细胞类型不同而异,如少突胶质细胞释放的外泌体可携带髓鞘蛋白脂蛋白(myelin proteolipid protein ,PLP)、2′3′-环核苷酸磷酸二酯酶(2′3′-cyclic-nucleotide-phosphodies-terase,CNPase)等[11],它们可能参与胶质细胞介导的轴突营养支持;而树突状细胞(dendritic cells ,DCs)释放的外泌体携带功能性肽-MHC复合物,可直接激活特异性抗原效应T细胞或传递给其他DCs以激活未激活的特异性抗原T细胞[12]。

2 外泌体在MS发病机制中的作用

研究提示外泌体在MS的病理生理和发病过程中起着关键作用。在MS患者的血清和脑脊液中外泌体含量明显升高[9],外周炎性细胞通过释放含有γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性细胞因子的外泌体,进而损伤内皮细胞,破坏血脑屏障,介导MS发病[13]。内皮细胞功能受损、血脑屏障通透性升高,进而使外周激活的淋巴细胞更易经损伤的BBB进入中枢神经系统,继发脱髓鞘、轴突破坏等一系列典型病理损伤。另一方面,这些囊泡中表达的炎性细胞因子打破Th17和Treg T细胞之间的平衡,促进疾病进展[14]。又有研究指出,外泌体参与MS的发病主要是因为外泌体中所含的miRNA。MS患者的血清中提取的外泌体含有一种miRNA是let-7i,其作用于幼稚T细胞,使幼稚T细胞向IFN-γ-IL-17A-Foxp3+CD4+T细胞分化减少[15],进一步降低体内Treg 细胞,破坏Th17/Treg平衡,从而导致疾病发生。在Murugaiyan等的研究中,miR-155被证实为实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠炎症反应的主要调控因素,靶向敲除miR-155基因导致中枢神经系统和外周淋巴器官中Th1和Th17细胞的分化减少,miR-155的敲除以及药物靶向治疗均导致EAE小鼠的发病过程延缓和疾病严重程度减轻[16]。此外外泌体中的miR-21和miR-219激活小胶质细胞和巨噬细胞,释放促炎因子TNF-α和IL-6等[17,18],促使MS的的发病和残疾进展,以上均说明外泌体通过不同的miRNA参与MS的发病过程。

然而,Thangavelu等提出,MS患者牙周膜干细胞分泌的外泌体可以通过调控TRL-4受体和NF-κB,进而调控NALP3,产生抗炎因子IL-10和TGF-β等,从而抑制EAE小鼠的炎症反应[19]。同时,低剂量IFNγ刺激DC细胞产生的外泌体中含有miR-219,可以增加髓鞘的生成和氧化应激的耐受能力[10],说明外泌体在MS的发病过程中有致病和抗炎双重作用,具体可能与细胞来源有关,其调控机制有待进一步研究。

3 外泌体在MS诊断中的作用

几乎所有体液中均在健康和疾病条件下检测到外泌体,包括尿液、血液、血清、脑脊液、母乳和精液等[20]。其含有的各种标记蛋白,奠定了外泌体可作为疾病诊断的生物标志物的分子基础。外泌体内包含的蛋白质、miRNA及其他核酸物质等,可以通过血脑屏障从血液进入大脑,行使细胞间通讯作用,间接反映脑内的状态,使其成为潜在的神经免疫性疾病生物标志物。

MS至今尚无高度特异的生物学标记物。近年的研究表明,MS患者的血清和脑脊液中所含外泌体可以作为一种诊断标志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌体中含有50多种蛋白质,且有30种已被报道与MS的疾病进展有关[21]。Azimi等研究观察到,在复发缓解型多发性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)患者中,与健康对照组相比,外泌体中miR-326的表达显著上调。这提示外泌体中这种miRNA的异常表达可能作为一种诊断和预后的生物标志物[22]。有文献指出,实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠脑脊液中小胶质细胞衍生的外泌体的浓度能反映病情的严重程度以及疾病阶段[23]。此外,在不同亚型的MS患者的血清中外泌体中均能检测到含量更高的MOG蛋白,且其严重程度与Gd增强MRI的表现一致[9]。并且内皮细胞分泌的外泌体联合CD31浓度的检测对MS的临床诊断与钆增强磁共振成像相比具有更高的灵敏度[3]。

研究进一步发现,外泌体不仅可早期诊断MS,更可以区别MS亚型。在不同亚型的MS患者分离的外泌体含有不同的miRNA,采用Logistic回归和ROC曲线、森林图等分析后发现不同亚型的miRNA表达量差别很大。单个miRNA区别亚型的概率仅66%,而联合多个指标敏感性可达95%[6]。揭示了外泌体的检测可以作为一个更简便更有效的诊断手段。Ebrahimkhani等通过采用下一代测序技术和综合生物信息学方法,揭示了血清外泌体miRNA谱能够准确地区分MS患者与健康对照组,同时还能区分RRMS与进展型多发性硬化(progressive multiple sclerosis, PMS)[24],为外泌体成为MS潜在的生物标志物提供了重要线索和依据。

4 外泌体在MS治疗中的作用

由于血脑屏障的存在,绝大部分药物不能直接通过血脑屏障进入中枢神经系统发挥作用。目前研制出的纳米颗粒药物技术也尚未成熟,纳米的毒性和快速被清除等问题也有待解决。外泌体是内吞的多泡体分泌而来,具有与人类细胞相同的胞膜和胞浆[2],可以有效通过血脑屏障,同时降低药物的清除率,可以作为有效的药物载体之一。

髓鞘再生是髓鞘损伤部位的信号因子募集少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPCs)到该损伤处后生成髓鞘[25],而促进髓鞘再生是延缓MS进展的治疗方向之一。研究指出,树突状细胞分泌的含有miR-219的外泌体,增加了髓鞘再生和氧化应激的耐受性[10],而Pusic等也证实了含有miR-219的外泌体能增加髓鞘再生[26],参与其免疫调节作用,从而抑制MS的进展。有研究发现[27],利用具有高表达配体 PDGF-A的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)释放的外泌体(extracellular vesicles and particles,EVPs),大大增强了对少突胶质细胞谱系的靶向能力。此外,与单独施用 EVPs 或 T3(三碘甲腺原氨酸)相比,全身注射 EVPs + T3 显著降低了EAE小鼠的临床评分,增强了少突胶质细胞的存活,抑制了髓鞘损伤,并促进了EAE小鼠的髓鞘再生,从而抑制疾病进展,这为MS提供了一种有效的治疗策略。

Manna等分析了MS患者在治疗前后的血液外泌体相关miRNA。结果显示,在接受干扰素-β(IFN-β)治疗的复发缓解型MS患者中,有14种外泌体相关miRNA明显下调,而有2种外泌体相关miRNA明显上调。这表明外泌体相关miRNA具有作为多发性硬化治疗反应生物标志物的潜力[28]。Riazifar采用EAE小鼠模型,对人间充质干细胞(MSCs)分泌的外泌体在治疗MS方面的效果进行了评估。结果表明,经IFNγ刺激的MSCs产生的外泌体(IFNγ-Exo)通过静脉注射与PBS对照组相比,能够显著降低EAE小鼠的平均临床评分,减轻脱髓鞘和神经炎症,并上调了EAE小鼠脊髓内CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Tregs)的数量[29]。Xue等设计制备了一种新型的纳米制剂,使用巨噬细胞衍生的外泌体作为载体负载天然产物白藜芦醇(RSV&Exo),研究发现在小鼠MS模型中,通过鼻内给药RSV&Exo显著抑制了中枢神经系统和外周的炎症反应,并有效改善了MS的临床进展[30]。因此,外泌体剂型能够作为MS的潜在治疗靶点,并有巨大开发研究前景。

5 外泌体在MS临床应用中的不足

目前外泌体的提取和保存尚存在一定的困难。首先,外泌体的分离目前还是依靠外泌体的直径、密度和生物标志物。而胞外囊泡含有三种:坏死小体、微粒体和外泌体。而外泌体(直径在30～150 nm)和微粒体(直径在20 nm～1 μm)直径有相交,导致提取的外泌体纯度不足[31]。其次,目前外泌体的提纯主要采用梯度离心后超速离心法,可能会导致外泌体分离物中含有微粒体和其他细胞碎片。且不同来源细胞的外泌体,其大小、密度、标志蛋白表达量都可能存在差异[32]。同时超速离心法本身对外泌体也有一定的损害[33]。近年来越来越多的分离方法涌现出来,如采用不同孔径和凝胶的滤过膜,多聚化合物如PEGs,免疫亲和法如磁分离法,纳米等离子体分析和动态光散射技术等,但目前在应用中均有限制。因此,研发既能获得高纯度又具有高特异性的外泌体,并确保其产量供应的方法,仍然是当前外泌体研究的核心方向之一。最后,尽管外泌体的推荐保存条件为-80 ℃,但在处理或运输过程中,有时难以保持这种低温环境。一项研究提出了一种冻干法,采用海藻糖作为保护剂,在冷冻过程中发挥生物保护作用,如稳定蛋白质、细胞膜和脂质体,减少冰的形成,避免蛋白质和外泌体的聚集,以及减少在分离和保存过程中损失细胞外囊泡等[34]。需要注意的是,由于不同来源的外泌体具有异质性,因此不同种类外泌体的最佳保存条件可能会有所不同,需要进一步研究探讨。此外,目前关于外泌体的不良反应仍不明确,也限制了其在临床中的应用[35]。

6 总结与展望

本文介绍了外泌体的生物学功能以及在MS的发病机制、诊断和治疗中的作用。外周炎性细胞通过外泌体刺激血脑屏障的内皮细胞,增加血脑屏障的通透性,导致脑内炎性细胞浸润,轴突破坏等。而MS患者的血清外泌体中含有特殊的miRNA,可对MS做出更有效的诊断。同时,外泌体标本主要来源于血清、尿液、唾液等,用于MS的诊断较长久以来MS患者依靠脑脊液免疫检测和MRI影像检查进行诊断的方法更加简单、无创。而具有脂质双层结构的外泌体,很好地保护了内含物质的降解,并且保存时间相对较长,加大了检测时间窗。此外外泌体能够很好地穿过血脑屏障,可以作为一种生物载体,参与MS的治疗。与此同时,外泌体中还含有许多其他物质如DNA、RNA、非编码RNA等,这些物质的作用是否与MS的疾病发生发展、诊断、治疗相关,尚有待进一步探索和证实。