新生儿滤纸干血片自动打孔检测系统检测葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶的性能评价

谭玉华（通信作者），潘晓芳，李高成，余海枷，陈梅欣，谭港澳，梁天铖，冯健明

1 广州市丰华生物工程有限公司体外诊断试剂研发中心 （广东 广州 510730）；2 广东省医疗器械质量监督检验所综合检验四室 （广东 广州 510663）

葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD）缺乏症在全世界分布广泛，致病原因为G6PD 基因突变导致G6PD酶活性缺失。据统计，我国G6PD 缺乏症分布呈南高北低趋势，广东、广西、海南、云南、贵州等地区人群患病率较高；而随着人口流动，患病率较低的地区也呈现增高趋势[1]。我国自1981年开展新生儿遗传代谢性疾病筛查（简称新筛）以来，多省市逐步增加了G6PD 缺乏症的筛查项目[2]。G6PD 缺乏症新生儿筛查为检测干血片的G6PD 酶活性，其筛查方法主要包括荧光定量法和荧光斑点法，其中荧光定量法因具有较高的特异度与灵敏度，而成为G6PD 缺乏症新生儿筛查的推荐方法。目前，新筛是通过实验室方法检测滤纸干血片相关指标来实现的，血片质量直接影响检测结果，且滤纸干血片同一血斑的不同打孔部位会对被检项目浓度在切值附近检测结果产生影响[3-4]。因此，血片打孔是实验室检测流程中的重要环节，规范操作对保证测定结果的准确至关重要[5]。既往滤纸干血片的质量评估及打孔取样均为人工操作，耗时长、效率低，容易出错。本研究旨在采用智能血卡分析系统、滤纸干血片自动打孔机、全自动荧光免疫分析仪和荧光定量法G6PD 测定试剂组成的新生儿滤纸干血片自动打孔检测系统进行G6PD 检测，并对其性能进行了评价，探讨其在新生儿G6PD 缺乏症筛查应用中的可行性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选 取2020 年12 月 至2021 年7 月 来 源 于 临 床科研合作单位的104 份新生儿滤纸干血片剩余样本，滤纸干血片G6PD 浓度值覆盖浓度范围在1.00～9.70 U/gHb。本研究所利用的剩余样本均非本研究试验目的专门采集，检测结果仅用于方法学比对试验，可视作对患者几乎没有任何风险，或受试者风险不大于最小风险，因此不再提交伦理委员会审评及受试者知情同意书[5-6]。

1.2 仪器与试剂

AutoTRFIA-4型全自动荧光免疫分析仪、KC2.0型智能血卡分析系统、Easy DBS 680型全自动打孔机、G6PD 测定试剂盒（荧光分析法）、滤纸干血片质控品和零浓度空白滤纸样本均由广州市丰华生物工程有限公司提供。新筛专用滤纸打孔钳由北京协和洛克生物技术研究开发中心提供。G6PD 制剂由Worthington 公司提供。

1.3 方法

按照仪器及试剂盒说明书进行各项参数设置，用校准品校准后，测定质控品结果，结果在控时，分析测定G6PD 的检测低限、线性、准确度、精密度和方法学比对试验结果，并与可接受标准进行比较。

由KC2.0型智能血卡分析系统、Easy DBS 680型全自动打孔机、AutoTRFIA-4型全自动荧光免疫分析仪和荧光定量法G6PD 测定试剂盒组成新生儿滤纸干血片自动打孔检测系统（简称自动打孔法），将新生儿血液采集卡放置于智能血卡分析系统中，采用数字图像处理技术评估滤纸干血片的采集质量，合格的滤纸干血片递送至全自动打孔机，通过图像识别技术精确算出打孔位置，从滤纸干血片圆斑上打下直径约为1/8 inch 的待测样本，并依次自动固定在血片支架（塑料排钉）上；固定在血片支架上的待测样本递送至AutoTRFIA-4型全自动荧光免疫分析仪，执行G6PD 检测程序；在白色板的微孔中每孔加入150 µl G6PD 底物试剂工作液，并依次将待测样本放置于加有底物试剂的白色板微孔中，待测样本与底物试剂在室温下缓慢振荡孵育30 min，移去扣有血片的支架，立即在白色板微孔中依次加入冷的铜试剂工作液（刚从冰箱取出，不复温）150 µl/孔，混匀后，白色板传送至判读仪中进行检测荧光计数值[单位：计数/秒（counts per second，CPs）]，并采用配套的软件进行结果分析。以新生儿筛查专用滤纸打孔钳手工打孔法检测G6PD（简称直接打孔法）为参比方法，直接打孔法通过工作人员肉眼评估滤纸干血片质量，合格的滤纸干血片采用打孔钳从滤纸干血片圆斑上手工打下直径约为1/8 inch 的待测样本，并将待测样本依次直接放置于白色板的微孔中，向每孔中加入复溶好的G6PD 底物试剂150 µl，并加贴封片，在室温下，缓慢振荡30 min，立即加入冷的铜试剂工作液150 µl/孔，混匀，在判读仪中检测荧光计数值，并采用配套的软件进行结果分析。

直接打孔法与自动打孔法平行检测104份新生儿滤纸干血片剩余样本。

1.4 评估指标

（1）检测低限评价：检测低限（lower limit of detection，LLD）定义为样品单次检测可以达到的检测响应量对应的分析物量；在零浓度空白滤纸样本的滤纸圆斑上打下10个血片检测荧光计数值，计算出荧光计数值的均值（x-）和标准偏差（s），将（±s）的荧光计数值代入对应的剂量-反应曲线计算出相应浓度值，即为方法的LLD，应符合试剂盒的性能要求（LLD 不高于0.50 U/gHb）。（2）线性和准确度评价：采用已知活性的G6PD 制剂，制备覆盖试剂盒线性范围1.00～10.00 U/gHb 的5个系列梯度浓度的滤纸干血片样本，在每个浓度的滤纸干血片圆斑上打下3个血片进行检测，分别取各梯度的实测浓度平均值作为测量结果，再将测量结果与样本理论浓度采用线性回归分析，r应大于0.9900；计算每个样本的测量结果与理论浓度的相对偏倚，应小于1/3总允许误差，总允许误差来源于国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价计划的评价标准中G6PD 室间允许误差（±30%）（简称G6PD 室间质评标准）。（3）精密度评价：使用同一批号的试剂盒和低水平（C1）、高水平（C2）2个滤纸干血片质控品，在每个水平的滤纸干血片圆斑上打下血片进行检测，每天做2个批次的测试，每批测试时，对同一样品作双份测量，共做20 d；评价结束时共有40对，即80个测试结果，参考EP5-A2[7]的计算方法，从40批次测量中双份结果的差值求出批内精密度；从所有80个数据计算出批间精密度；批内和批间变异系数（coefficient of variation，CV）应分别小于1/4允许总误差和1/3允许总误差，总允许误差来源于G6PD 室间质评标准（30%）。（4）方法学比对试验：直接打孔法与自动打孔法的检测结果采用线性回归分析，r应大于0.9900，截距a应与0的差异无统计学意义，采用线性回归方程对试剂盒阳性判断值2.5 U/gHb 进行预期偏倚估计，预期偏差的95%置信区间应在1/3总允许误差（G6PD 室间质评标准）内，采用Bland-Altman分析法进行一致性评价时，两种方法测定值差值中应不少于95%的样本差值位于一致性界限（limit of agreement，LoA）范围内[8]。

1.5 统计学处理

采用EXCEL 软件和SPSS Statistics 20.0软件进行数据统计分析，计量资料以±s 形式表述，方法学比对试验定量结果间差异采用配对t检验，并进行线性回归分析，r和截距a采用t检验分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测低限

检测G6PD 零浓度空白滤纸样本荧光计数值为（384±10）CPs，95%的可信限为404 CPs，在剂量-反应曲线计算出LLD 为0.29 U/gHb，满足试剂盒的LLD 性能要求。

2.2 线性和准确度评价

检测理论浓度在0.96～10.20 U/gHb 范围内的样本，实测浓度与理论浓度的线性回归方程为Y=1.0406X-0.0947，r=0.9996；实测浓度与理论浓度的相对偏倚均在可接受标准（±10%）内，见表1。

表1 线性和准确度评价结果

2.3 精密度

检测质控品C1和C2的批内CV均在可接受标准（小于7.5%）内，批间CV均在可接受标准（小于10%）内，见表2。

表2 精密度评价结果

2.4 方法学比对

直接打孔法和自动打孔法平行检测104例剩余样本，两种方法结果间差异无统计学意义（t=0.08，P>0.05），两者检测结果间的线性回归方程为Y=0.9993X+0.0049，r=0.9991（tr=244.74，P＜0.05），截距a与0 的差异无统计学意义（t=0.20，P>0.05），见图1。阳性判断值2.50 U/gHb 的预期偏倚为0.0032 U/gHb，预期偏倚的95%置信区间为（-0.017，0.024）U/gHb，在阳性判断值2.50 U/gHb的允许误差范围（-0.25，0.25）U/gHb 内，预期偏倚可以接受。Bland-Altman分析的LoA 为（-0.20，0.20）U/gHb，两种方法检测结果中有97.12%（101/104）的样本差值在LoA 内，满足可接受标准，见图2。

图1 两种方法检测样本结果的线性回归曲线

图2 两种方法检测结果的一致性分析

3 讨论

目前，新生儿滤纸干血片在检测前多由人工验收，验收合格后的样本多采用滤纸打孔钳手工直接打孔法进行打取样本，工作繁杂。新生儿滤纸干血片样本的质量问题可导致假阴性引起筛查漏诊，延误患儿早诊断和早治疗的最佳时机；假阳性过高也给新生儿及其监护人造成不必要复查和精神负担[9]。因此，采用智能化的血卡分析系统和自动打孔系统进行新生儿滤纸干血片打孔检测显得非常必要。

本研究中的自动打孔法采用智能血卡分析和滤纸干血片自动打孔技术，采血卡采集血样后，智能血卡分析系统通过工业级摄像头完成对滤纸干血片血斑的取景成像，通过数字图像处理技术，提取血斑阈值，识别血斑特征信息，可快速分析出采血卡采集的血斑是否有溶血、凝血、渗透不全和血液样本量不足等异常特征，并将判断结果通过网络直接上传至新筛中心服务器，且采血卡上会自动标识分析结果，方便工作人员对不合格样本的新生儿及时召回并重新采集血样；滤纸干血片自动打孔技术依靠精准的图像识别技术，捕获血斑成色并分层处理后，快速分析计算出合格的采血范围及采血打孔位置，从而精准智能的进行血片血斑的打孔取样；样本依次固定在血片支架（塑料排钉）上，方便样本一次性放入反应板孔内，自动打孔法不仅提高了筛查效率，节约实验室人力资源，还可降低了因人工操作产生的误差与风险，提高新生儿G6PD 缺乏症筛查的质量[10]。近年有报道表明，应用Panthera-PuncherTM9型干血斑打孔仪进行新生儿杜氏肌营养不良症筛查和G6PD 缺乏症筛查，该打孔仪包含1个摄像头可以实时提供打孔区域的清晰全彩视图，以及自动调整的冲孔图案来适应血斑的形状和尺寸，可自动将干血斑样本打冲至微孔板内，本研究的自动打孔原理与其相似[11-12]。

本研究中自动打孔法检测G6PD 的LLD 满足试剂盒的性能要求，线性范围优于缪海霞等[13]研究结果；准确度与精密度均已达到要求；自动打孔法与直接打孔法检测结果间无差异，且两种方法的检测结果具有高度相关性，阳性判断值预期偏倚的95%置信区间在可以接受范围内，采用Bland-Altman分析，自动打孔法与直接打孔法检测结果一致性良好，两者具有可互换性。

综上所述，新生儿滤纸干血片自动打孔法可通过智能血卡分析技术快速分析出采血卡采集的血斑的异常特征，并可智能、精准、高效地进行滤纸干血片血斑的自动打孔取样，LLD、线性、准确度和精密度等性能指标均符合可接受标准，且与直接打孔法检测结果间的一致性良好，两者具有可互换性。因此，自动打孔法应用于新生儿滤纸干血片样本G6PD 检测是可行的。