电针对卵巢早衰小鼠铁死亡的影响

耿子翔,聂小丽,刘鹏,袁龙,李冰融,张开勇,阎旻宇,凌乐乐,刘特,张必萌

(1.上海交通大学医学院,上海 200001;2.上海交通大学附属第一人民医院,上海 200080;3.上海市中医老年医学研究所,上海 200030)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是一种以闭经、不孕不育、雌激素水平低、促性腺激素水平高以及 40岁前女性缺乏成熟卵泡为特征的疾病[1]。其发病机制可能与遗传、放化疗、饮食、环境因素、免疫功能障碍等因素有关[2]。在中医古籍中并没有 POF的记载,根据其症状特点可以归属为“闭经”“血枯”“不孕”“经水早断”等中医学疾病范畴。中医治疗以补肾为主,同时结合疏肝、健脾、祛瘀、化痰和养血等辨证论治。针灸作为一种独特的中医疗法,在POF的治疗中发挥着重要作用。临床研究表明,针刺治疗POF的总有效率超过89%[3],且不良反应较少,仅部分人存在局部的不适。从运用针灸治疗POF至今,对其治疗方式和机制的研究一直在进行,但至今收效甚微,目前仅探明针灸发挥作用的机制可能是抑制原始卵泡的丢失、增加血清抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH)的分泌、诱导抗氧化和抗凋亡系统来减少卵巢功能衰竭[4-6]。因此本实验拟从电针的抗氧化和抗凋亡途径出发,验证电针对 POF小鼠的治疗作用并探究其可能的实现路径。

1 材料与方法

1.1 实验动物与方法

选取36只6～8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠,体质量(18±2) g,由上海交通大学附属第一人民医院实验动物中心提供。12 h昼夜节律交替,室温(20±2) ℃,室内湿度50%～70%,适应性饲养1周。所有动物实验及操作经上海交通大学附属第一人民医院动物伦理委员会通过(2020AW126)。

1.2 主要试剂与仪器

多聚甲醛(Sigma)、二甲苯(Sigma)、苏木精-伊红染料(Sigma)、RIPA裂解液(碧云天)、PVDF膜(Millipore)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(Invitgen)、逆转录试剂盒(TOYOBO)、PCR试剂盒(TOYOBO)、ECL试剂盒(Millipore)、RealPlex4实时 PCR检测系统(Eppendorf)、兔抗 GAPDH抗体(51332, CST)、Ferritin(4393, CST)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)(52455, CST)、B淋巴细胞瘤 2(B-cell lymphoma 2, BCL2)(3498,CST)、P53(9282, CST)。

1.3 造模方法

将36只小鼠随机分为对照组(wild type, WT)、模型组(premature ovarian failure, POF)和电针组(electroacupuncture, EA)组,每组12只。建立高脂高糖 POF模型[7], 8 g·kg-1高脂喂养,30%果糖溶液灌胃,每只200 µL,持续高脂高糖喂养8周,对照小鼠则正常饮食,每只生理盐水溶液灌胃 200 µL。造模结束后随机抽取4只模型小鼠取血取卵巢组织观察造模情况。应用 ELISA检测血清卵泡生成素(folliclestimulating hormone, FSH)、雌二醇(estradiol, E2)水平,HE染色观察卵巢组织病理以确认造模成功。

1.4 干预方法

WT组和POF组不作任何处理,EA组进行为期4周的电针治疗,选用直径0.18 mm、长度13 mm的无菌针灸针,以关元、双侧足三里和三阴交为针刺穴位,连接SDZ-V电子针灸仪,调整参数为 0.1～1 mA,1～3 Hz,连续波,对所选穴位进行刺激。每次30 min,每2日干预1次,连续4周。

1.5 标本采集

用 3%异氟烷溶液麻醉下颈椎脱臼法处死小鼠,快速进行眼球取血并分离血清。冰上取卵巢组织,去除卵巢附着脂肪,将卵巢冻于﹣80 ℃冰箱备用。

1.6 指标检测

1.6.1 组织病理学观察

取新鲜小鼠卵巢组织室温下在 4%多聚甲醛溶液中固定30 min。组织用乙醇溶液梯度脱水,石蜡包埋,切成6 µm切片,用二甲苯溶液浸泡脱蜡。组织切片用苏木精-伊红染色,二甲苯渗透,并用中性树脂固定。随后在显微镜下观察分析3组小鼠卵巢重量、健康及闭锁卵泡数目。

1.6.2 卵巢组织激素E2、FSH水平测定

将卵巢组织按1:9加入PBS缓冲液制备组织匀浆,离心取上清,按照说明书于 96孔板中加样,用酶标仪检测3组OD值,并计算血清E2和FSH激素水平。

1.6.3 小鼠卵巢组织Fe2﹢、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的检测

将卵巢组织置于裂解液中,冰上孵育 2 h,进一步超声裂解卵巢组织,离心取上清,冰上备用。分别按照Fe2﹢、MDA和SOD检测试剂盒要求加入反应液和检测试剂,用酶标仪分别检测3组OD值,并计算卵巢中Fe2﹢、MDA和SOD含量。

1.6.4 RT-qPCR检测

使用Trizol溶液从每个卵巢样本中分离总RNA。用逆转录试剂盒逆转录。使用SYBR Green检测染料和RealPlex4实时 PCR检测系统对 18S、GPX4、BCL2、Ferritin、BAX基因进行qPCR。qPCR扩增40个循环,95 ℃变性 15 s,58 ℃退火 45 s,用 2﹣ΔΔCt法计算相对基因表达值。根据18S rRNA水平校准mRNA水平。引物序列详见表1。

1.6.5 Western blot检测

取小鼠卵巢组织加入 RIPA裂解液后进行冰上研磨、超声。离心后取上清备用。利用12%的SDS-PAGE进行蛋白电泳,并转移到 PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后,在室温下用TBST清洗PVDF膜3次各10 min,然后在 4 ℃下一抗 GAPDH(1:1 000)、Ferritin(1:1 000)、GPX4(1:1 000)、BCL2(1:1 000)、P53(1:1 000)孵育过夜。重复以上清洗过程,将膜与山羊抗兔二抗(1:1 000)孵育1 h。清洗后,使用 ECL试剂盒显影观察,并用Image J软件计算灰度值。

1.7 统计学方法

所有数据采用 SPSS22.0统计学软件进行统计分析。正态分布的计量资料用均数±标准差表示;若数据方差齐则组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA);若方差不齐则组间比较采用 Student’stest检验;不符合正态分布的数据采用 Kruskal-Wallis秩和检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠卵巢组织病理结构比较

与WT组相比,POF组成熟卵泡消失,卵巢重量减轻,正常卵泡比例下降而闭锁卵泡比例升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。在经过4周的电针治疗后,成熟卵泡重新出现(直线标注处),与POF组比较,EA组卵巢重量明显恢复,闭锁卵泡比例下降,而正常卵泡比例升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。详见图1。

图1 3组小鼠卵巢组织病理结构比较(HE×200,±s, n＝6)

2.2 3组小鼠血清激素水平比较

与 WT组比较,POF组小鼠血清 E2水平显著降低,FSH水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与POF组比较,EA组小鼠E2水平显著升高,而FSH水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。详见图2。

图2 3组小鼠血清激素水平比较(±s, n＝6)

2.3 3组小鼠卵巢组织Fe2﹢、MDA和SOD水平比较

与WT组比较,POF组小鼠卵巢组织Fe2﹢和MDA水平显著升高,而 SOD水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。与POF比较,EA组小鼠卵巢组织内MDA和Fe2﹢水平显著降低,而 SOD水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。提示电针可以抑制POF小鼠卵巢内的氧化应激反应。详见图3。

图3 3组小鼠卵巢组织Fe2﹢、MDA和SOD水平比较(±s, n＝6)

2.4 3组小鼠卵巢组织内Ferritin、GPX4、BCL2、BAX mRNA水平比较

与WT组比较,POF组小鼠卵巢组织内Ferritin、

GPX4、BCL2基因表达水平显著降低,BAX基因表达水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与POF组比较,EA组小鼠卵巢组织内Ferritin、GPX4、BCL2基因表达显著升高,而BAX基因表达显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01)。详见图4。

图4 3组小鼠卵巢组织内Ferritin、GPX4、BCL2、BAX mRNA水平比较(±s, n＝6)

2.5 3组小鼠卵巢组织内Ferritin、GPX4、BCL2、BAX蛋白表达的比较

与WT组比较,POF组小鼠卵巢组织内BCL2、GPX4、Ferritin蛋白表达水平显著降低,P53蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与POF组比较,EA组小鼠卵巢组织内BCL2、GPX4、Ferritin蛋白表达显著升高,而P53蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01)。详见图5。

图5 3组小鼠卵巢组织内Ferritin、GPX4、BCL2、BAX蛋白表达的比较(±s)

3 讨论

针灸在临床应用上十分常见,并且被认为是治疗卵巢早衰(POF)最有前景的手段之一。但临床上治疗POF时穴位选取复杂多样,难以在动物实验中复现。因此,确定一个针灸治疗 POF的基础穴位配伍对其机制研究十分重要。中医学认为POF是由于先天不足、气血亏虚、邪气外侵和情志失调等多种病因的存在,引起肾肝脾等多脏腑功能失调。其核心病机为肾精亏虚,天癸早竭,冲任受损,从而使人体生殖功能早衰。因此,在POF治疗时以补肾为主,同时结合疏肝、健脾、祛瘀、化痰和养血等辨证论治。最近的研究表明,关元-足三里-三阴交是治疗POF时最常被使用的穴位[8]。针刺关元、足三里、三阴交可以改善患者的FSH和LH等激素水平,促进卵泡发育[9],其作用机制可能跟 PI3K-AKT-mTOR信号通路激活有关[4-5]。另外,针刺产生的信号会沿着一定的外周和中枢径路逐步传导到脑的高级部位,进而启动免疫-神经-内分泌网络系统,从而恢复卵巢的正常机能[4-6]。以关元-足三里-三阴交为基础穴位配伍体现了近治与远治作用相结合,通过补虚泻实以实现标本同治。运用该基础穴位配伍对POF小鼠进行电针治疗,发现电针可以显著改善小鼠的卵巢损伤,恢复卵巢重量,促进卵泡发育并降低闭锁卵泡比例。此外,电针还可以改善 POF小鼠的内分泌情况,调整性激素(E2、FSH、黄体生成素等)的释放水平,显著恢复卵巢储备。

研究表明 POF的发生与饮食和环境因素密切相关[2]。前期发现高糖高脂饮食诱发的高过氧化水平在POF的发生发展中发挥了重要作用[7,10]。高脂高糖饮食不仅会增加肥胖的风险,还会严重影响卵巢功能和卵母细胞质量[7]。此外,人体内的高过氧化水平往往诱导自身免疫系统的改变,通过增强免疫细胞活性导致POF的发生[10-14]。脂质过氧化是铁死亡发生的前提。铁死亡是一种不同于凋亡、坏死和自噬的铁依赖的新型细胞程序性死亡方式,其主要发生机制是铁离子或脂加氧酶催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸引起脂质过氧化和抗氧化系统(Xc-系统)中 GPX4的表达减少[14-19]。事实上,铁死亡是否发生取决于铁离子积累诱导的过氧化物和氧自由基生成与对抗脂质过氧化的Xc-之间的平衡。在POF小鼠卵巢中,可以明显观察到MDA浓度显著升高,SOD浓度和GPX4表达水平显著降低,而电针治疗后,过氧化物生成和抗氧化系统重新建立平衡。另外,POF小鼠卵巢中Ferritin表达显著降低,铁蛋白被消耗转化成大量铁离子,而电针治疗后Ferritin表达水平显著恢复。以上结果表明电针可以抑制脂质过氧化诱导的铁死亡。

除此之外,研究还发现电针可以显著降低 P53和BAX的表达水平,升高BCL2的表达水平。这表明电针可以通过抑制细胞凋亡,促进卵泡生长发育,减少卵泡闭锁,增强卵巢储备功能[4,6,20-21]。值得一提的是,细胞凋亡与铁死亡存在密切的联系。P53不仅仅是促凋亡基因,而且还是 Xc-系统的抑制剂,可以通过靶向SLC7A11抑制GPX4、GSS等抗氧化基因的表达[22-23]。因此,电针治疗后POF小鼠卵巢内P53的表达降低进一步证明了电针的抑制铁死亡作用。

综上所述,本研究表明电针可能通过提高 Xc-系统的GPX4表达降低POF小鼠的脂质过氧化水平,避免Fe2﹢的蓄积,从而减少铁死亡对POF小鼠卵巢组织的损伤。并且电针还可以通过升高BCL2和降低P53、BAX表达水平减少卵巢内细胞的凋亡,促进其增殖,恢复卵巢储备。本研究探索了电针对POF的治疗作用,创新性地发现了 POF小鼠中存在铁死亡现象,阐述了电针可能通过提高GPX4表达抑制铁死亡发挥治疗作用。这为临床应用电针(关元-足三里-三阴交)治疗POF奠定了理论和实验基础,并对电针治疗 POF的机制提供了新的见解。