HPLC-DPPH法在线分析远志抗氧化活性成分研究*

2023-02-23曲浩源王海波裴帅龙鲁茂盛

云南化工 2023年1期

邸学,曲浩源,王海波,裴帅龙,鲁茂盛

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600)

传统的天然抗氧化活性产物研究，一般是通过一系列的成分分离和和纯化技术得到提取物或单体成分，再进行体内或体外活性测定，因此，研究周期长、效率低，又较为盲目，而且不利于性质不稳定化合物的抗氧化活性发现[6-7]。HPLC-DPPH在线筛选抗氧化成分，是将色谱柱分离后的样品溶液与DPPH 溶液混合，反应后流入检测器进行检测，抗氧化活性化合物与DPPH反应，使其吸收减弱从而形成倒峰；通过对比样品HPLC色谱图和DPPH自由基清除反应后HPLC图谱，即可进行不同成分抗氧化活性的在线分析[8-9]。该方法能够直观反映混合样品中不同成分清除自由基能力，实现混合样品中不同成分分离和抗氧化活性的同步测定，具有高效、原位、简捷、快速等优势，近年来已逐渐应用于天然抗氧化活性成分的筛选分析。

远志的皂苷、多糖、黄酮等组分的抗氧化活性已有相关研究，但其中的糖酯类活性成分的抗氧化活性的研究报道较少。本试验研究通过HPLC-DPPH法在线分析、全面筛选远志的抗氧化活性成分，并采用对照样品对照量化其抗氧化活性的效应，方法操作简便、高效，为远志的药效活性物质成分研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1100液相色谱仪；Boltimate C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱后反应器(0.25 mm×20 m，仪佳科技有限公司)；RPL-D2000 柱温箱(大连日普利科技仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

2-联苯基-1-苦基腈基(DPPH)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯)，购于天津市凯信化学工业有限公司；磷酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，购于天津市光复科技发展有限公司；过硫酸钾、L(+)-抗坏血酸，购于国药集团化学试剂有限公司；西伯利亚远志糖酯A6(SA6)、3,6’-二芥子酰基蔗糖(DSS)，购于成都普菲德生物技术有限公司；纯净水，购于杭州娃哈哈公司。远志，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为远志科远志属植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

供试品溶液的制备：取远志药材适量，加8倍量水，煎煮提取2次，每次 2 h，合并提取液；减压浓缩至 20 mg/mL，加甲醇稀释至 10 mg/mL，微孔滤膜滤过，备用。

对照样品溶液的制备：精密称取DSS、SA6对照品适量，分别加入甲醇配制成质量浓度为 0.1 mg/mL 的对照品溶液，备用。精密称取Trolox对照样品，加入甲醇分别配制成质量浓度为 0.01 mg/mL 的对照样品溶液，备用。

DPPH反应液的制备：精密称取DPPH试剂适量，加入甲醇配制成质量浓度为 10 μmol/L 的溶液，备用。

2.2 HPLC-DPPH法分析条件

分析试验装置及流程：参考文献并优化试验装置流程，试验流路体系分别为样品高效分离路径(A)和DPPH自由基清除检测系统路径(B)。待测样品由路径A 经液相色谱法分离后与DPPH自由基溶液经三通连接管混合，进入规格为 0.25 mm×20 m 的反应器充分反应。再经检测器检测获得样品反应后的色谱图。分别以甲醇溶液、DPPH溶液或对照样品溶液为对照，对比分析远志成分抗氧化活性。

远志成分分析：色谱柱为Agilent C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱温 40 ℃；流速 0.25 mL/min；进样量 5 μL；流动相为0.05%磷酸水(A)-0.05%磷酸乙腈(B)。梯度洗脱条件：0～5 min 8%～20%(B),10～32 min 26%～32%(B),35～42 min 55%～8%(B)。检测波长为 320 nm。

HPLC-DPPH在线分析：为保证色谱分离效果和抗氧化活性试验结果的准确性和灵敏度，对DPPH反应液浓度(5、10、20 μmol/L)、远志洗脱液与DPPH溶液的体积比(2∶3、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、混合及反应时间(0.6、0.8、1.2 min)、反应温度(25、30、40 ℃)等多种因素影响进行优化，确定反应条件为DPPH反应液浓度为 10 μmol/L，流速为 1 mL/min，反应器规格为 0.25 mm×20 m，反应物的质量比1∶4、反应时间 0.8 min，反应温度 40 ℃，检测波长是 517 nm。