一例鸡尾鹦鹉鸟肠球菌感染的临床报道

黄潇航 ，王海论 ，彭佳佳，李诗艺，张 龙，贺金峪，王诗晨，黄志坚，殷光文

（1.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福州，350002；2.福建省动物药物工程实验室，福州，350002；3.福建省畜牧兽医研究所，福州，350013）

鸡尾鹦鹉（Nymphicus hollandicus）是一种中小型鹦鹉，成鸟尾羽修长，胆小机警，智商较高，可学人语，市场常见灰色、珍珠灰和黄色等观赏品系。在我国江苏、河南等地作为主要的鹦鹉繁育品种被饲养繁育，具有较高的观赏和经济等价值。李顺才等［1］总结了鸡尾鹦鹉的人工养殖技术，指出近年该种类鹦鹉的繁育趋势呈现普及化。作为观赏鸟饲养，国内在该类鹦鹉的育雏等方面有较多的临床累积资料，但在病毒等临床防控方面，尤其是分子诊断方面的报道较少。鸟肠球菌（Enterococcus avium）是一种医学临床多见的致病菌，在肝、脑等脓肿病料中较为多见，其可与非肠链球菌（Streptococcussp.）［2］、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）［3］等发生混合感染。本研究就1 例急性、典型神经症状，以死亡转归的鸡尾鹦鹉雏鸟为研究对象，从临床症状、病原微生物和组织病理学诊断等方面进行综合报道，以期为国内动物园、养殖场等相关饲养繁育机构和养殖爱好者提供参考。

1 发病情况

家养观赏鸡尾鹦鹉品种为人工繁育的鸡尾鹦鹉黄化品系，雌性，1 月龄，经过长途运输抵达饲主家中。前2 d 活泼好动，食欲正常，采用木盒饲养并使用加热垫供暖。第2 天前夜加热垫断电停止供暖。第3 天出现精神萎靡、背羽凌乱、眼睑肿大和站立无力等症状，粪便为黑绿色，泄殖腔处羽毛脏乱，出现脖颈强直扭曲等神经症候，最后呼吸减弱，体温升高，最终死亡。经饲主同意后剖检。

2 实验室检查

2.1 寄生虫检查

采集死亡鸡尾鹦鹉肠道内容物、粪便和黏膜刮片，以及肝、肾和肺等组织进行涂片和压片检查寄生虫感染情况。

2.2 细菌分离鉴定

在无菌环境下采集死亡鸡尾鹦鹉心、肝、脾和肾等病料，接种于普通琼脂培养基和绵羊血琼脂培养基，置于恒温培养箱中37 ℃培养24 h，观察有无菌落生长。挑取菌落做肉汤培养基扩增培养16 h 后，进行革兰氏染色观察、细菌生理生化鉴定和动物回归试验。根据试验结果开展药物敏感性试验，共测试20 种常用抗生素：头孢哌酮、多黏菌素B、四环素、头孢氨苄、头孢曲松、万古霉素、链霉素、哌拉西林、红霉素、庆大霉素、青霉素、头孢呋辛、阿米卡星、头孢唑林、多西环素、米诺环素、头孢他啶、氨苄西林、林可霉素和卡那霉素。

2.3 动物回归试验

测定分离获得的鸟肠球菌悬液OD600为0.685，攻毒接种于28 日龄的温氏麻黄2 号雏鸡（由福建农林大学家禽孵化实验室提供）。攻毒组（5羽）肌内注射0.8 mL 菌悬液，空白组（5 羽）肌内注射0.8 mL 灭菌氯化钠溶液，同等条件饲养观察7 d，记录存活率，以评估该菌株的致病力。

2.4 病毒分离鉴定

采集部分脏器组织，无菌研磨破碎后，使用高压灭菌生理盐水按照1∶5 的比例制备悬浮液，使用组织提取试剂盒完成RNA 和DNA 的提取，设计合成特异性扩增引物进行样本的RT-PCR 分子检查。用于扩增新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）和鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）的引物序列（表1）。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，其中用于扩增CIAV 的引物根据参考文献［4］合成，其余引物为自行设计合成。

表1 试验用病毒检测引物信息Tab.1 Primers information of virus detection in this study

2.5 病理组织学检查

采集死亡鸡尾鹦鹉和攻毒雏鸡病变较为明显的组织脏器，浸泡福尔马林溶液后制备石蜡病理组织标本切片，采用苏木精-伊红染色（HE染色）。

3 结果

3.1 剖检与寄生虫检查

死亡鸡尾鹦鹉头骨外观可见出血点（图1A），脑组织出血、液化。体腔剖检发现心脏充血肿大，腺胃充血，肺和肝伴有出血，十二指肠和空肠可见出血，盲肠淤血，肾可见尿酸盐沉积，其余脏器未见明显异常（图1B）。未见寄生虫感染。

图1 鸡尾鹦鹉剖检结果Fig.1 Skull and body cavity of the Nymphicus hollandicus

3.2 细菌分离鉴定

通过平板划线培养24 h 后，在哥伦比亚血琼脂平板上分离获得具有金属光泽和α溶血特性的菌落（图2A）。通过对分离的单菌落进行革兰氏染色，在油镜下可观察到成对短链状的球菌，革兰氏染色结果为阳性（图2B）。

图2 鸡尾鹦鹉细菌分离鉴定结果Fig.2 Bacterial isolation and identification of Nymphicus hollandicus

生化试验结果显示：分离菌株能发酵葡萄糖产酸、产气，能利用乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇和木糖，七叶苷试验为阳性（表2）。

表2 鸟肠球菌生化试验结果Tab.2 Biochemical test results of Enterococcus avium

使用16S rRNA 通用引物对获得细菌（命名为JWYW-01）的DNA 16S rRNA 进行PCR 扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳获得阳性片段，长度约为1 600 bp（图3），使用胶回收试剂盒回收DNA 片段，送往福州博尚生物技术有限公司测序。使用DNAStar 7.0 软件对拼接基因进行同源性分析，通过与NCBI中的细菌同源性比对，下载多动物源分离株16S rRNA 序列，发现该分离株的16S rRNA 与Enterococcus avium（MT_604783.1）具 有99.8% 的同源 性。使 用MeAlign 软件的邻近树法，重复测序计算1 000 次构建JWYW-01 的遗传进化树，发现该菌株与Enterococcus avium（MT_604783.1）聚于一支，与Enterococcus pseudoavium（NR_028705.1）和Enterococcus malodoratus（NR_042055.1）等肠球菌种形成明显分支（图4）。综上，结合生理生化鉴定结果，本研究分离获得的菌株为鸟肠球菌。

图3 鸡尾鹦鹉肝脏分离细菌的16S rRNA PCR产物Fig.3 16S rRNA PCR product of bacteria isolated from liver of Nymphicus hollandicus

图4 鸡尾鹦鹉肝脏分离细菌的16S rRNA基因核苷酸序列系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene nucleotide sequence of bacteria collected from Nymphicus hollandicus liver

3.3 药物敏感性试验

采用抗生素测试试剂盒（常德比克曼生物科技有限公司生产）对头孢哌酮和多黏菌素B 等20 种常用药物进行敏感性试验。测定抑菌圈大小并记录（图5）。

图5 鸡尾鹦鹉肝脏分离细菌的药敏试验结果Fig.5 Results of drug sensitivity test for the bacteria isolated from liver of Nymphicus hollandicus

药物敏感性判断参考唐云云等［5］的研究，当抑菌圈直径＞15 mm时，为高度敏感；当抑菌圈直径10～15 mm 时，为中度敏感；当抑菌圈直径＜10 mm 时，为低度敏感。分离菌株对18 种常用抗生素表现为低度敏感，但对哌拉西林（PRL）和米诺环素（MIN）表现为中度敏感，说明PRL 和MIN 可用于鸟肠球菌的预防和发病早期的临床治疗。

3.4 动物回归试验

攻毒试验结果显示，鸟肠球菌对雏鸡具有一定的致病性，致死率为20%，耐受过的鸡群可恢复采食。发病雏鸡临床表现为精神萎靡，食欲不振，并伴有腹泻等症状，与原病患鸡尾鹦鹉临床症状类似，剖检可见胃肠道等多脏器出血（图6）。从病死雏鸡肝中可分离获得类似形态的细菌。

图6 雏鸡攻毒后胃肠道和脑部病变Fig.6 Gastrointestinal and brain lesions in chicks after challenge

3.5 病毒分离鉴定

临床样本中均未检出NDV、IBV和CIAV。

3.6 病理切片

病理切片显示：鸡尾鹦鹉肝脏出血较严重，出现局部炎性浸润现象（图7A），肺大量出血（图7B），脑部神经元固缩和坏死（图7C），提示脑部神经发生病变，胃充血（图7D），十二指肠黏膜损伤严重（图7E），其中基底层形态发生改变。使用分离菌株接种雏鸡后，发现雏鸡的肺和肾等组织脏器的临床宏观病变与死亡鸡尾鹦鹉类似，肝大量出血（图8A），肺出现严重出血（图8B），脑部组织神经元固缩并伴有出血征（图8C），胃基底层出血（图8D），十二指肠肠黏膜损伤严重，伴有炎性浸润（图8E）等，整体病理变化为出血。

图7 鸡尾鹦鹉病理组织检查结果（HE ×200）Fig.7 Histological examination results of the Nymphicus hollandicus（HE ×200）

图8 雏鸡攻毒后的病理变化（HE ×200）Fig.8 Pathological changes in chicks after challenge（HE ×200）

综合临床症状、病原微生物鉴定和组织病理学结果，判断鸟肠球菌感染是导致鸡尾鹦鹉死亡的重要原因。

4 讨论

鸟肠球菌是可导致腹膜炎［6］、髂腰肌脓肿和股骨头骨髓炎菌血症［7］、脑脓肿［8-9］及脾脓肿［10］等疾病的病原微生物，在食品安全和公共卫生等领域由于其耐药性［11-13］和隐蔽性等而被研究人员广泛关注。国内外曾报道过猪源鸟肠球菌的临床致病案例［5，14］，本研究报道了鸡尾鹦鹉鸟肠球菌的致病案例，并通过雏鸡回归接种试验，发现该株鸟肠球菌对禽类也具有一定的条件致病性。通过药物敏感性试验发现该菌株仅对20种常用抗生素中的哌拉西林（PRL）和米诺环素（MIN）2种药物中度敏感。

对于本案例，笔者认为长途运输应激和发病前夜供暖设施的停用是诱发鸡尾鹦鹉疾病的主要原因。我国在虎皮鹦鹉（Melopsittacus undulatus）、牡丹鹦鹉（Agapornissp.）等常见观赏鹦鹉种类的神经系统疾病研究中，已经报道了巴氏杆菌（Pasteurella）［15］等相关致病源，但尚未见鸟肠球菌感染诱发鹦鹉神经疾病的相关报道。本研究是国内关于鸡尾鹦鹉鸟肠球菌条件致病的临床案例，从临床症状、病原微生物和组织病理学诊断等多方面对该病进行了较为系统的介绍，旨在为相关饲养和繁育单位提供防治参考。