海藻多糖–纳米硒的结构及其促进水稻硒累积的机理

王潮鑫，杨春妹，张 木，沈 宏*

（1 华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510642；2 广东省农业科学院农业资源与环境研究所，广东 广州 510642）

硒(selenium，Se)是人体必需的微量元素，缺硒会诱发克山病、大骨节病、甲状腺功能减退和免疫系统减弱等症状[1–3]。而人体自身无法合成硒，只能通过食品药品等途径摄入硒元素。水稻是我国南方最主要的粮食作物，通过外源施硒提高大米硒含量是满足缺硒地区人群对硒日常需求的有效办法。

可用于提高稻米硒含量的硒源包括硒酸盐、亚硒酸盐、硒氨基酸和纳米硒(selenium-nanoparticles，SeNPs)。目前，在农业种植生产中广泛使用硒酸盐和亚硒酸盐，但其安全范围较窄，存在硒毒害风险[4]。纳米硒指的是尺寸在0～100 nm的红色零价单质硒。Zhang等[5]采用化学方法合成纳米硒颗粒，并发现纳米硒颗粒具有较高的生物活性以及较宽的安全施用范围。但前人对纳米硒的研究多集中在医学上的抑菌、抗氧化、抗癌等效果，在农业上应用很少[6–8]。近几年，纳米硒对农作物的影响受到越来越多的关注，纳米硒能提高辣椒中辣椒素的含量，促进次生代谢产物和抗氧化剂的积累[9]；也能提高金丝小枣的硒含量、产量和品质[10]。Zahedi等[11]还发现叶面喷施纳米硒能减轻盐胁迫对草莓生长和产量的影响。纳米硒与硅、硫等元素配合施用还可以缓解重金属对水稻的胁迫[12–13]。但是通过物理化学方法合成的纳米硒需要加入稳定剂以保持其稳定性和活性，且不同的稳定剂对纳米硒的性质和应用效果有较大影响。前人利用壳聚糖、茶多糖、葡聚糖、黄芪多糖和海藻多糖等制备了天然多糖稳定纳米硒[2, 14–16]。

多数研究使用的是商品纳米硒肥[17–18]，其稳定剂成分未明，是否加入稳定剂也同样未知，因此难以深入研究纳米硒在农业生产中的应用。成分确定的多糖纳米硒则多数被应用于药品、食品添加剂、饲料添加剂等领域，且海藻多糖在农业中已被广泛应用[19–21]，但将海藻多糖结合纳米硒用作肥料还未见报道，海藻多糖与纳米硒结合是否能产生更好的农作物富硒效果值得深入研究。

针对上述问题，本研究先通过单因素试验和响应面法优化制备出海藻多糖−纳米硒(alginate polysaccharide selenium-nanoparticles，APS-SeNPs)，并对APS-SeNPs进行形貌表征及表面性能分析，进而研究在大田条件下喷施APS-SeNPs对水稻(Oryza sativa L.)硒累积的效果，以期为富硒水稻生产提供解决方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海藻提取液由本实验室制备得到[22]，海带购于广州申晶雅农业科技有限公司。抗坏血酸(Vc)购于国药集团化学试剂有限公司。亚硒酸钠(Na2SeO3)和硒酸钠(Na2SeO4)购于北京化工集团有限公司。水稻种子(粳稻‘洛稻998’和籼稻‘川香优2号’)由广东省农业科学院水稻研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 海藻多糖−纳米硒的制备工艺优化 APSSeNPs的制备步骤：以海藻提取液作为溶剂制备0.5 mol/L Na2SeO3母液，参考 Mansouri-Tehrani 等[15]、Hu 等[2]、穆静静等[23]的方法。称取 1.8 g Vc 于 200 mL烧杯中，加入适量海藻提取液，在40℃条件下搅拌溶解，滴加5 mL Na2SeO3母液(硒添加量2000 mg/L)，继续加海藻提取液至100 mL，在40℃条件下持续搅拌反应40 min。

抗坏血酸还原法制备纳米硒的反应式如下[24–25]：

按照上述步骤，分别改变硒添加量(1000、2000、4000、6000、8000 mg/L)、硒酸比 (Na2SeO3与 Vc 的摩尔比 1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、反应温度(30℃、40℃、60℃、80℃、90℃)、反应时间(5、10、20、40、80、120 min) 4 个因素中的一个，其余因素保持不变。测定反应产物的粒径以及Zeta电位。

根据单因素试验结果分析，使用Design-Expert 12软件设计三因素三水平的响应面试验方案，因素水平如表1所示。然后对软件分析得到的最佳制备工艺条件所制备的APS-SeNPs进行表征。

表1 APS-SeNPs主要制备条件的响应面设计Table 1 Response-surface design of main preparation conditions of APS-SeNPs

1.2.2 海藻多糖−纳米硒对水稻硒累积效果 2021年3—11月在华南农业大学增城教学实验基地(113°57′E，23°35′N)进行大田试验，连续种植两季水稻。采用随机区组设置，将试验田分为10个小区(每个小区长8.0 m，宽1.2 m)，幼苗移栽两天前将基肥(N∶P2O5∶K2O = 24∶8∶20)施入土壤，用量为 250 kg/hm2，水稻生长期间按当地正常大田条件管理。第一季水稻收获后，将稻田灌满水，两天后施入等量基肥并重新整田，将提前培育了45天的幼苗移栽，种植第二季水稻。

处理设置如下：对照 (清水)、5 mg/L APS-SeNPs、25 mg/L APS-SeNPs、5 mg/L Na2SeO3、25 mg/L Na2SeO3。两个水稻品种共10个处理。其中Na2SeO3为不含海藻提取液的水溶液，APS-SeNPs由最佳工艺条件制备后加入乙醇进行离心沉淀，倒掉上清液后进行冷冻干燥，得到APS-SeNPs冻干粉加水稀释至相应浓度。处理方法为：在水稻灌浆期间进行叶面喷施处理一次，用量3000 L/hm2。水稻成熟后，每个处理小区随机选取3个点各收获1 m2的水稻作为3次重复，以测定相关指标。

1.3 海藻多糖−纳米硒理化性质测定方法

1.3.1 Zeta电位和粒径 APS-SeNPs的制备反应结束后，根据穆静静等[23]的方法，将APS-SeNPs用超纯水稀释至10 mg/L左右，使用激光粒度分析仪(Zatesizer Nano ZSE)分别测定 APS-SeNPs的 Zeta 电位和粒径。

1.3.2 纳米硒含量 在反应产物中加入乙醇进行离心沉淀，倒掉上清液后进行冷冻干燥，得到APSSeNPs冻干粉，加水进行重悬浮，称取0.5 g重悬浮液采用氢化物发生—原子荧光光度法(GB 5009.93-2017)测定APS-SeNPs的浓度。

1.3.3 傅里叶红外光谱分析 (FTIR) 称取 0.05 g 的冻干粉和1 g的溴化钾混匀后压片，然后使用傅里叶变换红外光谱仪(Vertex 70，BRUKER，德国)进行测定。以APS作为对照。

1.3.4 透射电镜分析(TEM)与能谱分析(EDS) 称取0.1 g的APS-SeNPs冻干粉加入超纯水定容至500 mL进行重悬浮，稀释至10倍后滴加到铜网上，待完全干燥后使用场发射透射电子显微镜(FEI Talos F200S，赛默飞，美国)进行观察，并做透射电镜−能谱分析(TEM-EDS)。以不添加APS所制备的SeNPs作为对照。

1.3.5 表面张力 采用Wilhelmy吊片法[26]，将玻璃培养皿用待测样品润洗后，倒入样品至培养皿1/2高度，使用全自动表面张力仪(BZY-1，上海衡平仪器仪表厂，中国)测定APS-SeNPs的表面张力。以相同浓度的SeNPs、Na2SeO3、Na2SeO4溶液以及400倍APS-SeNPs稀释液作为对照。

1.3.6 接触角[27]剪取新鲜水稻叶片，用双面胶粘贴在载玻片上，使用接触角测量仪(OCA20，DATAPHYSICS，德国)测定APS-SeNPs在水稻叶片上的接触角。以相同浓度的SeNPs、Na2SeO3和Na2SeO4溶液作为对照。

1.3.7 持液量 参考张鹏九等[28]的方法。剪取水稻剑叶，记录好原始重量后叶面朝上平放在桌面上，将配置好的样品溶液在叶片上均匀喷洒5次，然后将叶片垂直夹起使多余的溶液离开叶片，再次称量叶片的总质量；将叶片擦干后附上标尺拍照，使用imageJ软件计算叶片面积，计算出叶片的持液量。单位为mg/cm2。

1.4 水稻相关指标的测定

1.4.1 产量及产量构成 将水稻自然风干后，每个重复随机选取3株水稻，计算每株穗数、每穗粒数以及千粒重，随后将所有风干后的水稻进行打谷，测定单位面积的产量。

1.4.2 总硒含量 将收获后的叶片和籽粒用清水清洗，吸水纸擦干表面水分后将籽粒进行脱壳，分为叶片、稻壳和糙米3部分烘干粉碎后，采用氢化物发生—原子荧光光度法测定各部位硒含量。

1.4.3 硒的转运系数 糙米硒浓度与叶片硒浓度之比为硒的转运系数，转运系数越高代表植物叶片吸收的硒转运到大米的能力越强。

1.4.4 有机硒含量 根据Wang等[29]的方法，在3 g 样品中加入 3.5 mL 的 4 mol/L 盐酸，在 100℃ 沸水中水浴10 min，然后在4℃条件下2500 r/min离心10 min，将上清液用超纯水定容至10 mL，采用氢化物发生—原子荧光光度法测定无机硒含量，将总硒含量减去无机硒含量计算出有机硒含量。

1.5 数据统计与分析

统计分析使用软件SPSS 20.0，响应面法相关图表使用软件Design-Expert 12绘制。

2 结果与分析

2.1 反应条件对制备海藻多糖−纳米硒的影响

由不同硒添加量对APS-SeNPs透明度的影响(图1)可知，将所有样品统一稀释至500 mg/L后，硒添加量1000和2000 mg/L的样品颜色透亮，其背后的文字清晰可见，而在硒添加量4000、6000和8000 mg/L时出现浑浊，背后的文字无法看清。如图2-a所示，APS-SeNPs在硒添加量1000～2000 mg/L的粒径和Zeta电位绝对值分别在53.58～54.75 nm和42.48～43.99 mV，硒添加量 4000 mg/L 时颗粒直径显著上升至137.04 nm及Zeta电位的绝对值下降至36.06 mV，硒添加量再升高，颗粒直径再升高，Zeta电位绝对值再下降。这与图1结果一致，表明APSSeNPs体系的静电稳定性在硒添加量≥4000 mg/L时显著下降。

图1 不同硒添加量制备的APS-SeNPs透明度对比Fig. 1 Transparency comparison of APS-SeNPs prepared with different levels of Se addition

Na2SeO3与Vc的摩尔比(Se∶Vc)对APS-SeNPs粒径和Zeta电位的影响如图2-b所示，当硒酸比为1∶2时，虽然体系的Zeta电位绝对值高于30 mV，但其颗粒直径较大(139.50 nm)。而当硒酸比在1∶3～1∶6时，体系颗粒直径与Zeta电位绝对值分别在 47.89～85.29 nm 和 42.39～47.88 mV，均处于非常稳定的状态。其中，硒酸比为1∶5时粒径最小(47.89 nm)，稳定性最高 (−47.88 mV)。

反应温度对APS-SeNPs粒径和Zeta电位的影响如图2-c所示，随着反应温度的提高，纳米硒粒径先变小后变大，在温度≥80℃时超过了100 nm (155.96 nm)；Zeta电位先升后降，在90℃时无法保持稳定(−26.78 mV)。纳米硒的粒径和 Zeta电位在 40℃时均处于最佳。

反应时间对APS-SeNPs粒径和Zeta电位的影响如图2-d所示，Vc对亚硒酸盐的还原需要时间，随着反应时间的延长，体系的颗粒直径逐渐下降并趋于稳定，在≥20 min时粒径基本在47.61～53.04 nm。Zeta电位也有相同的趋势，5 min 时只有−27.24 mV，20 min 之后稳定在−40.64～−45.16 mV。APS-SeNPs在反应20～120 min内的粒径和Zeta电位均较为接近，因此20 min为制备APS-SeNPs的最佳反应时间。

图2 不同反应条件制备的APS-SeNPs粒径及其Zeta电位Fig. 2 Particle size and Zeta potential of APS-SeNPs prepared under different reaction conditions

上述结果表明，不同条件下纳米硒的Zeta电位与粒径有相反的变化趋势。因此选择粒径作为唯一响应值进行响应面设计。

2.2 响应面优化试验结果分析

通过单因素试验确定了影响APS-SeNPs粒径和稳定性的主要因素为硒添加量(A)、硒酸比(B)以及反应温度(C)，从而设计了三因素三水平的响应面，试验结果如表2所示。将试验结果使用Design Expert 12软件进行响应面拟合分析，得到APS-SeNPs粒径响应值(Y)和各因子(A、B、C)之间的多元回归模型：

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response-surface analysis scheme and experimental results

回归模型的方差分析结果表明，该二次多项式回归模型极显著(F=107.31, P<0.00001)，说明该模型各因素与其响应值之间有着极为显著的相关性。同时失拟项的P值为0.5696大于0.05并不显著。模型的R2为0.9928，调整后的R2为0.9836，与预测的R2(0.9508)相差小于0.2。说明该二次多项式回归模型拟合程度良好，可对APS-SeNPs合成粒径进行分析和预测。

对回归模型进行分析之后得到3个因素对APSSeNPs粒径影响的三维立体响应曲面和等高线图(图3)。三维立体响应曲面和等高线图可以生动地反映保持一个影响因素在中心值不变的前提下，其余两个影响因素对响应面值的影响，等高线的椭圆化程度与两个因素交互作用的显著程度呈正相关，椭圆化程度越高，说明交互作用越显著[30]。如图3-d、f所示，等高线近似椭圆，说明硒添加量与硒酸比、硒酸比与反应温度的交互作用显著。由图3-e可见，硒添加量和反应温度的交互作用不显著。从三维响应曲面可直观看出，两个因素之间对粒径的影响呈凹面，能在图上看到最低点，说明各因素的取值范围合理。

图3 硒添加量、硒酸比和反应温度之间成对比较的三维立体响应曲面(a、b、c)和等高线图(d、e、f)Fig. 3 Response-surface (a, b, c) and contour map (d, e, f) for pairwise comparison of Se addition, Se:Vc ratio and reaction temperature

采用 Design Expert 12 软件预测 APS-SeNPs制备的最佳条件。结果显示APS-SeNPs制备的最佳条件为硒添加量2850 mg/L，硒酸比18.85%，反应温度32.2℃，此条件下APS-SeNPs的粒径最小，预测值为38.5 nm。为方便试验，在硒添加量为2800 mg/L，硒酸比为19∶100 (19%)，反应温度为32℃的条件下进行验证试验。上述试验条件下得到APS-SeNPs的粒径为38.94±2.26 nm，与理论预测值接近，同时其静电稳定性较高 (Zeta 电位−52.17±1.30 mV)。因此可以确定APS-SeNPs的最佳制备条件为硒添加量2800 mg/L，硒酸比19∶100，反应温度32℃，反应时间20 min。最佳制备条件下得到的APS-SeNPs浓度为 2430±32 mg/L。

2.3 海藻多糖−纳米硒的电镜观察与能谱分析

由SeNPs与APS-SeNPs的透射电镜观察结果(图4)可知，SeNPs和APS-SeNPs的平均粒径均在50 nm左右，其中SeNPs (图4-a)的纳米颗粒呈现椭圆形，颗粒成形较差，且颗粒之间出现聚集的现象。但APS-SeNPs (图4-b)的纳米颗粒呈圆球形，颗粒之间的间隙清晰分明，并且体系分散均匀稳定。以上结果表明，APS-SeNPs形成的纳米颗粒大小均一，稳定性好。

图4 SeNPs (a)与APS-SeNPs (b)的透射电镜(TEM)扫描图Fig. 4 Transmission electron microscopy (TEM) scanning of SeNPs (a) and APS-SeNPs (b) particle

通过扫描透射电镜−能谱图观察了APS-SeNPs的元素分布(如图5所示)。图5-a显示出了APS-SeNPs颗粒的位置，明显呈现圆形颗粒状，图5-b、c、d中氧、硫、硒元素的主要荧光区域高度重合，集中分布在纳米颗粒上；纳米硒的特征峰在1.39、11.25和12.49 keV，APS-SeNPs颗粒的硒原子比达到了28.90%，质量比达到了71.59%。上述结果表明APS与纳米硒成功结合形成APS-SeNPs。

图5 APS-SeNPs的透射电镜−能谱分析(TEM-EDS)Fig. 5 TEM-EDS analysis of APS-SeNPs

2.4 海藻多糖−纳米硒的红外分析

采用FTIR分析了APS与APS-SeNP的红外光谱图(图6)，APS与APS-SeNPs的吸收峰高度相似，说明两者相互结合。APS谱图中，波数为3436.98 cm−1的吸收峰属于O—H伸缩振动产生的强吸收峰，波数为1637.48 cm−1的吸收峰属于C=O不对称伸缩振动产生的吸收峰，波数为676.98 cm−1的吸收峰属于C—H弯曲振动产生的吸收峰。APS-SeNPs的谱图吸收峰与APS吸收峰基本相同，但在1415.68 cm−1处出现了新的吸收峰。

图6 APS-SeNPs和APS的红外光谱图Fig. 6 FIIR spectra of APS-SeNPS and APS

2.5 海藻多糖−纳米硒的表面张力与接触角分析

为了探究APS-SeNPs在水稻叶片上的表面性能，测定了不同硒源的表面张力、持液量和接触角(表 3)。同一浓度的 Na2SeO3、Na2SeO4和 SeNPs溶液的表面张力均显著高于APS-SeNPs。Na2SeO3、Na2SeO4和SeNPs的表面张力接近水的表面张力，而APS-SeNPs的平均静态表面张力为46.23 mN/m，与APS的表面张力接近(46.96 mN/m)。此外，APSSeNPs 400 倍稀释液的表面张力 (65.80 mN/m)也显著低于Na2SeO3、Na2SeO4和SeNPs。4种溶液在水稻叶片上的持液量和接触角支持了上述结果： APSSeNPs在叶片上的持液量最大、接触角最小。上述结果表明，APS-SeNPs在水稻叶片上的停留效果好于 Na2SeO3、Na2SeO4和 SeNPs。

表3 不同硒源的表面张力和接触角Table 3 Surface-tension and contact-angles of selenium sources

2.6 海藻多糖−纳米硒对水稻各部位硒累积的影响

不同硒源叶面喷施处理下不同水稻品种的各部位硒含量不同(表4)。无论喷施何种硒源，两个水稻品种各部位硒含量均随着施硒浓度的增加而增加，并且各部位硒含量大小为叶片>稻壳>糙米。在同一浓度处理下，APS-SeNPs处理的水稻各部位硒含量均高于Na2SeO3处理。但两个品种间存在差异，对于‘洛稻998’，其叶片和稻壳两部位的提升比例较高，APS-SeNPs处理比Na2SeO3处理提高了34.2%～74.3%，而糙米硒含量只提升了10.5%～29.1%；对于‘川香优2号’，叶片、稻壳和糙米的提升不明显，其中糙米硒含量比Na2SeO3处理提升了2.2%～34.5%。值得一提的是，‘洛稻998’喷施25 mg/L APS-SeNPs或 25 mg/L Na2SeO3处理的糙米中硒含量高于0.3 mg/kg，超过国家富硒标准(0.04～0.30 mg/kg，GBT 22499—2008 富硒稻谷)，而其余施硒处理的糙米硒含量均在国家富硒标准范围内。

表4 喷施不同浓度APS-SeNPs和Na2SeO3对水稻各部位硒含量和硒转运系数的影响Table 4 Effects of concentrations of APS-SeNPs and Na2SeO3 on Se content in different parts of rice and transport coefficient

结合两季的硒转运系数可知，外源施硒会降低水稻对硒的转运能力。APS-SeNPs处理与Na2SeO3处理的变化趋势相同，随着施硒浓度的增加，两种水稻对硒的转运系数逐渐降低，从0.17下降到0.07。

2.7 海藻多糖−纳米硒对糙米有机硒和无机硒含量的影响

为了研究喷施APS-SeNPs对两种水稻大米中硒的生物有效性的影响，测定了糙米中的有机硒和无机硒的含量。两季的数据基本一致，因此只讨论第一季的结果。如图7所示，洛稻998和川香优2号糙米中有机硒和无机硒的比例随不同硒源的变化趋势一致，两种水稻糙米中的硒主要以有机形式存在。施硒处理的糙米有机硒比例在70.9%～85.3%，空白对照的无机硒则未检出(无机硒含量低于0.05 μg/L，可视有机硒比例为100%)，且随着施硒浓度的提高，APS-SeNPs和Na2SeO3处理的糙米有机硒比例均逐渐下降，说明外源施硒会降低大米中硒的有效性。但值得一提的是，相同施硒浓度条件下，APS-SeNPs处理的水稻有机硒比例显著高于Na2SeO3处理。且APS-SeNPs处理的川香优2号有机硒比例比Na2SeO3处理高4.8～7.6个百分点，而洛稻998只高了2.1～3.4个百分点。说明不同品种对APS-SeNPs的转化能力不同，川香优2号对APSSeNPs的转化能力更强。

图7 喷施不同硒源糙米中有机硒和无机硒的比例Fig. 7 Proportion of organic and inorganic Se in brown rice as affected by Se sources

2.8 海藻多糖−纳米硒对水稻产量及产量构成因素的影响

如表5所示，两季的数据略有差异，但趋势相同。对于‘洛稻998’，与对照相比，5 mg/L的APSSeNPs与Na2SeO3处理的千粒重分别显著增加10.2%～11.1% 和 8.1%～8.7%，25 mg/L APSSeNPs和Na2SeO3处理差异不显著；各处理之间的株穗数和穗粒数均没有显著差异；5 mg/L APSSeNPs处理较对照增加了7.6%。对于‘川香优2号’，只有5 mg/L Na2SeO3处理的千粒重较对照显著增加14.6%～20.0%，其余处理虽表现为高于对照趋势，但差异不显著；第一季5 mg/L Na2SeO3处理增产明显。‘川香优2号’的产量及产量构成因素测定结果均高于‘洛稻998’，各处理的变化趋势与‘洛稻998’一致。上述结果表明，APS-SeNPs主要通过影响水稻千粒重提高水稻产量。

表5 两种水稻大田收获产量及产量构成Table 5 Harvest yield and yield composition of two rice cultivars

3 讨论

3.1 海藻多糖−纳米硒制备条件分析

纳米硒颗粒直径越小，其各项性能表现越好[25]。Zeta电位则被用来评价体系的稳定性，当电位的绝对值大于30 mV时，体系处于稳定状态，高于40 mV时体系处于非常稳定的状态。多数研究认为，蛋白质和多糖等稳定剂通过对纳米硒的表面进行包裹，从而避免纳米硒颗粒之间因直接接触而聚沉失活[15, 31]。因此，Se与APS的比例会对APS-SeNPs的稳定性产生很大影响，在APS浓度不变的情况下，Se的添加量是有限的。在保证纳米硒较小的粒径以及较高的静电稳定性情况下，尽可能地提高纳米硒的浓度可以降低肥料的运输成本。因此选择硒添加量2000和4000 mg/L作为响应面实验设计的−1和1水平。

Na2SeO3与Vc的摩尔比对纳米硒的粒径和静电稳定性有着显著影响。理论上，亚硒酸盐与Vc的还原反应计量比为1∶2，为了保证充分反应，一般会添加过量的还原剂。本研究的结果(图2-b)支持了上述观点，当硒酸比为1∶2时反应产物粒径较大，可能是体系中的还原物质不够导致纳米硒无法保持分散状态[32]。但当体系中的还原物质充足时，不同的稳定剂具有不同的最佳硒酸比和反应温度。如喻波[33]以壳聚糖为稳定剂制备纳米硒的最佳硒酸比为1∶4，最佳反应温度为65℃；高娟等[34]以菊糖为稳定剂，其最佳硒酸比则为1:3，最佳反应温度为100℃；叶锡光[25]以茶多糖为稳定剂的最佳硒酸比为1∶8，最佳反应温度为40℃。而本试验(图2-b、c)选择硒酸比1∶6和1∶4 (17%和25%)、反应温度30℃和60℃作为响应面试验设计的−1和1水平。

稳定剂与纳米硒的反应需要一定的时间，时间长短与稳定剂相关。如王红艳[24]以壳寡糖为稳定剂制备纳米硒，发现其在反应110 min后趋于稳定；叶锡光[25]则选用60 min作为制备茶多糖−纳米硒的最佳反应时间。本研究中，当反应时间超过20 min后，APS-SeNPs的粒径和Zeta电位趋于稳定，说明反应时间不是影响APS-SeNPs粒径和静电稳定性的主要因素，因此选择20 min作为制备APS-SeNPs的最优反应时间。

3.2 海藻多糖−纳米硒的形貌分析

当一种化合物与一种单质通过次级键结合时，该化合物的红外光谱部分吸收峰会发生偏移。所有以多糖为稳定剂制备的纳米硒在3400、1600 cm−1处的吸收峰会发生偏移，这是纳米硒与多糖分子中的O—H键(拉伸和振动)结合产生的非化学键所导致的[2, 23, 35]。少数的研究发现多糖与纳米硒的结合还会伴随新的吸收峰产生，如Mulla制备的印楝叶提取物−纳米硒的红外光谱在1456 cm−1处出现了因Se—O键结合而产生的新吸收峰[36]。本研究结果(图6)与其相似，也在1415.68 cm−1处出现了新的吸收峰，说明APS与纳米硒的结合同时不仅生成了次级键使得红外光谱发生偏移，还生成了Se—O化学键从而产生新的吸收峰。但是新吸收峰的峰值较小，说明只有少量的化学键生成，纳米硒体系的稳定主要靠多糖与纳米硒的次级键维系。

不同文献记载的纳米硒中硒氧原子的比例不尽相同，这似乎与硒和稳定剂的相对浓度以及稳定剂的类型有关[3, 37]。Xiao 等[38]发现当冬虫夏草胞外多糖的含量相同时，硒糖质量比为1∶3时，其硒氧原子比为1∶27；硒糖质量比为1∶1时，其硒氧原子比则为1∶1.5。按照多糖和单糖的化学式 (C6H10O5)n推算，每个硒原子结合一个多糖或单糖分子，其硒氧原子比应在1∶5～1∶6。APS-SeNPs中的硒氧原子比接近5∶2 (图5-e)，说明在最优工艺条件下有超过一半的纳米硒未与APS结合，即可能只有颗粒表面的硒与外层包裹的多糖结合。但硒氧结合比例是否对纳米硒各项性能产生影响还需要进一步的研究。

3.3 海藻多糖−纳米硒对水稻硒累积的影响

植物叶片吸收硒的第一步是硒元素停留在叶片上并进入叶片内部[39]，但叶片表面的蜡质层具有疏水性，使得液体难以在叶片表面停留，如果溶液的表面张力过大会使得植物不易被湿润从而导致硒肥的施用效果下降[27]。因此，降低硒肥的表面张力无疑能够提高叶面肥料的利用率。而海藻提取物中既有—COOH、—OH等亲水基团，又有—CH3、—NH2等疏水基团，能够充当表面活性剂，使得APS-SeNPs的表面张力(表3)显著小于Na2SeO3和Na2SeO4。因此，利用海藻提取物降低纳米硒溶液的表面张力使硒纳米颗粒在叶片长期停留并被气孔更多地吸收，可能是APS-SeNPs处理的水稻叶片硒吸收量大于Na2SeO3处理的原因。同时，张木等[40]发现提高水稻的硒含量可以增强叶片光合作用以及水稻对氮素的同化代谢能力。但与之相对的是，过高浓度的硒会与硫发生竞争，占据硫的转运通道，大量取代硫元素合成硒蛋白，干扰了硫的正常代谢活动，从而抑制了水稻的正常生长[41]。APS-SeNPs对两个水稻品种具有增产的作用，但高浓度的硒处理会减弱水稻增产效果(表5)。这与宋会明等[10]在金丝小枣上的研究结果一致，说明适当低浓度的硒处理更有利于水稻生产。

水稻将硒转运至籽粒的能力对富硒大米生产有着显著影响。不同硒源在水稻体内的转运能力不同，如姜超强等[42]认为亚硒酸盐在水稻中的转运系数低于硒酸盐是由于在水稻体内进行转运的硒是硒酸盐形态，而亚硒酸盐转化为硒酸盐的过程较根部吸收亚硒酸盐的过程慢，从而导致水稻根部累积大量的硒。尽管有研究表明植物叶片与根系对硒的吸收有较大差异[43]，但硒在穿过表皮细胞进入叶片后，同样需要跨过质膜进入叶肉细胞，并发生一系列的形态转化和转运过程[44]。这表明叶片转运硒的机理可能与根系相似。而本研究中，水稻对APS-SeNPs和Na2SeO3的转运系数均随施硒浓度的增加而逐渐下降，相同施硒浓度下，水稻对两种硒源的转运系数没有明显规律(表4)，因此，APS-SeNPs转化为硒酸盐的途径和效率与亚硒酸盐转化为硒酸盐的途径和效率是否有相同之处，还需要进一步试验证明。

外源施硒提高作物硒含量被认为是缓解人体缺硒的理想途径，因为植物可以将无机硒转化为更加安全且容易被人体吸收的有机硒形式[45]。已有研究表明，不同硒源在植物体内的转化途径不同，硒酸盐的还原需要亚硫酸盐还原酶的参与，而亚硒酸盐则进行转化效率更高的非酶还原[44]，使得亚硒酸盐比硒酸盐更容易被同化为硒氨基酸。而本研究中，相同施硒浓度下APS-SeNPs处理的糙米硒含量和有机硒比例都显著高于Na2SeO3处理(表4、图7)。即在总硒含量相同的情况下，APS-SeNPs处理的糙米有机硒比例大大高于Na2SeO3处理。这与Wang等[17]的研究结果相似，其发现SeNPs在水稻体内向有机形式的转化比例高于Na2SeO3和Na2SeO4。说明SeNPs在植物体内的转化途径与硒酸盐和亚硒酸盐不同，可能存在更加高效的转化途径。

有机硒包括硒蛋白、硒多糖、硒核酸等成分，但主要以硒蛋白的形式存在，因此，多数研究只测定了硒蛋白的含量[45]。本研究发现水稻喷硒处理后糙米中的有机硒比例在70.9%～85.3%。而前人研究测定的水稻籽粒中的硒蛋白比例范围较大，占籽粒总硒的百分比在 40%～100%[29, 46–48]。这可能是由于硒形态测定前需要将有机硒释放出来，但目前对样品的前处理没有统一的方法，所以导致不同研究对有机硒测定结果相差较大。

4 结论

海藻酸纳米硒APS-SeNPs的最佳制备工艺条件是：硒添加量2800 mg/L，Na2SeO3与Vc的摩尔比19∶100，反应温度32℃，反应时间20 min。在此工艺条件下，APS-SeNPs颗粒均匀(粒径38.94 nm)，间隙分明，分散稳定(Zeta电位−52.17 mV)。

海藻多糖APS与纳米硒结合产生了新的化学键Se—O，同时还降低了肥料溶液的表面张力，延长了APS-SeNPs在水稻叶片上的停留时间，因而促进了水稻对硒的吸收和利用，特别是提高了糙米中有机硒的比例。喷施5 mg/L APS-SeNPs，糙米硒含量可到达国家富硒标准，因此，APS-SeNPs是生产富硒大米的优质硒肥。