毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

2023-02-22毛琳琳朱瑞利易可可段志龙王秀斌孙静文

植物营养与肥料学报 2023年1期

毛琳琳，朱瑞利，易可可，段志龙，王秀斌，周卫，孙静文*

（1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081 / 农业农村部植物营养与肥料重点实验室；2 延安市农业科学研究所，陕西延安 716000）

磷是核酸、脂质、糖类等生物大分子的重要组成部分，在细胞代谢活动、酶的调控反应中起着至关重要的作用[1–3]。尽管在土壤中磷含量丰富，但其扩散速率较低，易被金属离子固定，不易被植物吸收利用[4], 因此土壤中磷的有效性并不高。在低磷环境下，植株生长缓慢、矮小且瘦弱，同时生育期延迟，并最终导致农作物减产[5]。在生产中通常会施用磷肥来解决作物缺磷问题，但当季磷肥利用率并不高，通常在10%～25%，同时过度施用磷肥会造成磷矿资源枯竭和水体富营养化等负面影响[6]。因此，提高植物自身对磷的吸收显得尤为重要。

多年来，育种学家们通过杂交育种或分子改良等方法来提高作物对磷的吸收和利用能力以提升作物对低磷环境的适应性[7–8]。PHR基因是植物响应低磷胁迫的关键调控因子，可通过启动下游基因的表达来提高植物对磷的吸收，被启动的功能基因主要包括促进根系伸长基因和磷的转运蛋白基因等[9–10]。PHR基因对下游基因的调控作用最早在拟南芥中报道，目前共发现15个AtPHR家族成员，其中PHR1基因是参与低磷调控最重要的一个基因。水稻中的同源基因为OsPHR2，与AtPHR1有相同的功能[10]，同时 OsPHR3、OsPHR4 基因等相继被发现[11–12]。在拟南芥和水稻模式植物中，大多数磷饥饿响应基因都是被 AtPHR1 和 OsPHR2 以及其同源基因 AtPHL1、AtPHL2、OsPHR1 和 OsPHR3 诱导而激活[13–14]。因此，通过转录因子诱导下游磷吸收相关基因的表达，来提高转基因植物抗低磷胁迫能力一直是国内外研究的热点。迄今为止，已经从拟南芥、水稻、小麦、玉米、油菜等多种植物中克隆出PHR转录因子。在豆科植物中，已从大豆中克隆了35个PHR基因，并将其中的GmPHR25转入到大豆中，在低磷胁迫下，获得的转基因植株根毛中11个磷转运基因及5个磷饥饿响应基因的表达显著提高[15]。同时，在NCBI GenBank中还能搜索出苜蓿等的PHR基因序列，但没有相应基因的生物学功能报道。因此，总体来说豆科植物PHR基因功能的相关研究较少。

毛叶苕子(Vicia villosa)是重要的豆科绿肥作物，具有较强的固氮能力，翻压还田可以有效提高土壤中养分含量，改良土壤结构。但是其对磷利用率低，吸收利用土壤难溶性磷酸盐的能力较差，极大地限制了其在绿肥翻压还田增加土壤有效磷含量中的应用。长期以来关注毛叶苕子氮素养分吸收及释放规律多，其磷素养分吸收转运的相关研究少。同时，关于PHR基因的研究都是在模式植物如水稻、拟南芥开展的，非模式植物特别是绿肥作物上的研究甚少。毛叶苕子中PHR基因的生物学功能是否与模式植物一致，目前并不清楚。因此，本研究从毛叶苕子中克隆PHR基因，研究该基因的亚细胞定位特征及转录自激活功能，进一步将该基因分别在野生型及Atphr1突变体拟南芥中表达，研究转基因材料的生理表型及磷含量变化，以期深入揭示毛叶苕子PHR基因的生物学功能，为遗传改良磷高效毛叶苕子品种、阐明绿肥作物耐低磷胁迫的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试毛叶苕子品种为‘苏联毛苕’和‘徐苕3号’，由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所曹卫东研究员提供，phr1突变体拟南芥由清华大学刘栋教授提供。植物总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购于TIANGEN生物公司。大肠杆菌 DH5α感受态细胞、农杆菌GV3101感受态细胞、酵母AH109感受态细胞均购于北京擎科生物技术有限公司。试验所设计的引物由上海生工生物工程有限公司合成。克隆载体pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-GFP均购于北京华越洋生物公司。

1.2 毛叶苕子转录组测序及PHR基因相关转录本表达分析

设置两个处理：1)正常磷 (200 μmol/L Pi)；2)低磷(2 μmol/L Pi)，3次重复。在智能光照培养箱中(26℃，16 h 光照；20℃，8 h 黑暗)，采用 Hoagland改良营养液进行培养，营养液pH为6.3 ± 0.1，每隔3天更换1次营养液。

选取正常磷和低磷处理12天的‘苏联毛苕’和‘徐苕3号’的地上部和根系，每个处理3次生物学重复，共计构建24个基因文库。为消除个体间差异，将低磷处理12天相同品种的毛叶苕子5株混合取样，每个材料取3次生物学重复，样品经液氮速冻后−80℃保存，用于RNA提取。委托美吉生物医药科技有限公司完成基因文库构建和转录组测序。采用单分子实时测序技术(SMRT)进行毛叶苕子全长转录组测序。使用RSEM比对软件(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)对转录本的表达水平进行定量分析，利用 FPKM (fragments per kilobases per million reads)法计算基因表达量，即每一百万条序列中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的reads (建库时打断获得的fragments，当以PE测序时，同一个片段包含两条reads)个数。具体公式如下：FPKM=某基因唯一比对到基因的fragments数/(某基因的长度×唯一比对到参与基因组的总fragments数)×109。

1.3 VvPHR1基因的克隆

基于毛叶苕子3代全长转录组测序获得PHR序列信息，设计上下游引物，正向引物序列为primer F：5′– ATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTCAATTG–3′，反向引物序列为 primer R：5′–TCAATGGGGCTTA GTTTTTTTTTCTCCAGC–3′。采用 TIANGEN 公司的试剂盒提取毛叶苕子总RNA，以毛叶苕子总RNA为模板，用Promega公司的AMV反转录酶试剂盒进行逆转录，获得毛叶苕子cDNA。利用PCR方法从cDNA中扩增PHR基因全长ORF，反应体系为 cDNA 1 μL、2×KOD Buffer 25 μL、dNTPs 5 μL、KOD酶1 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR 反应条件为 95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃10 s，72℃ 1 min；28 个循环；72℃ 5 min 。PCR 产物胶回收后连接到pMD18-T克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后提取质粒DNA，将质粒送北京博迈德生物科技有限公司完成测序，获得毛叶苕子PHR基因序列，命名为VvPHR1基因。

1.4 VvPHR1基因的亚细胞定位分析

根据VvPHR1基因的开放阅读框设计特异性引物 (primer F：5′– AACACGGGGGACGAGCTCGGTA CCATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTC–3′; primer R：5′– ATGATACGAACGAAAGCTCTGCAGATGGG GCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC–3′)，采用高保真酶扩增获得VvPHR1基因全长ORF(去除终止密码子TGA)，采用无缝克隆与pCAMBIA-35S-EGFP载体连接构建融合表达载体，参照郭贞慧[16]的方法制备水稻原生质体和烟草细胞，采用PEG介导法和农杆菌注射法将构建好的重组质粒pCAMBIA-VvPHR1-EGFP分别转入水稻原生质体和烟草细胞中，在光照培养箱中于25℃下光照培养48 h，采用激光共聚焦显微镜 (ZEISS LSM- 510 META，Germany)观察其亚细胞定位。

1.5 VvPHR1基因的转录激活功能分析

根据 VvPHR1 设计特异性引物 (primer F：5′– A GGCCGAATTCCCGGGATGGAAGCTCGTCCTGCT–3′; primer R：5′–GCCGCTGCAGGTCGACTCAATG GGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC–3′)，扩增VvPHR1基因的ORF，与用XmaI和SalI双酶切后的表达载体pGBKT7连接，构建重组质粒pGBKT7-VvPHR1，经测序验证后转入酿酒酵母AH109，以pGBKT7空载体作为阴性对照，按照100、101、102、103、104和105等6个浓度梯度均匀涂于SD/−Trp单缺陷平板、SD/−Trp/−His 两缺平板、SD/−Trp/−His/−Ade三缺陷平板上培养，观察转化子的生长情况，再挑选转化子涂于 SD/−Trp/−His/−Ade(+X-αgal)显色平板，进行β-半乳糖苷酶活性检测，并拍照记录。

1.6 VvPHR1基因遗传转化拟南芥

根据VvPHR1的开放阅读框设计含有酶切位点的特异性引物 (primer F：5′– GGGGTACCATGG AAGCTCGTCCTGCTTTCTC–3′; primer R：5′– ACG CGTCGACTCAATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCC AGC–3′)，采用高保真酶扩增获得VvPHR1全长ORF，选用限制性内切酶KPNI和SALI酶切载体pCAMBIA1300以及带有酶切位点VvPHR1全长ORF，采用T4连接的方法将目的基因与pCAMBIA1300-35S载体连接构建融合表达载体pCAMBIA1300-35SVvPHR1，然后通过电击法，将融合表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞。

播种前将拟南芥种子放置于4℃冰箱春化2天，然后营养土装盆播种拟南芥，待其抽薹开花后进行花序侵染。将冷冻保存的含pCAMBIA1300-35S-VvPHR1农杆菌菌液活化培养后用于侵染拟南芥。活化后的农杆菌菌液加入15 μL表面活化剂Silwet-77，震荡混匀，利用沾花法分别侵染野生型及phr1突变体拟南芥。剪去已经开过的拟南芥的花与籽粒荚，留下花蕾备用。将拟南芥花浸入农杆菌悬浮液30 s并套袋处理，重复侵染2～3次。在光照培养箱中培养 (23℃，16 h 光照；20℃，8 h 黑暗)，30 天后，收集成熟种子(T1代)后放置37℃烘干，之后置于4℃保存。

通过潮霉素对T1代拟南芥种子进行抗性筛选，获取阳性转基因植株(图1)。然后通过PCR检测潮霉素抗性基因(Hyg)，对转基因植株进行进一步鉴定，检测引物：Hyg(501) F：GAGCATATACGCC CGGAGTC；Hyg(501) R：CAAGACCTGCCTGAA ACCGA，结果显示抗性植株扩增出约501 bp的目标条带(图2)。连续加2代，获得稳定遗传的T3代转基因拟南芥。

图1 转基因拟南芥潮霉素抗性苗筛选Fig. 1 Screening of hygromycin-resistant seedlings in transgenic Arabidopsis thaliana

图2 转基因拟南芥电泳检测Fig. 2 Electrophoretic test of transgenic Arabidopsis thaliana

1.7 实时荧光定量PCR

将生长30天的正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1 μmol/L Pi)处理的野生型(WT)和过表达型(OEPHR1)拟南芥取样，液氮速冻，提取拟南芥总RNA，使用Promega公司的AMV反转录酶试剂盒逆转录成cDNA，使用 SYBR Green Pro Taq HS qPCR Kit(Accurate Biotechnology)试剂盒进行荧光定量PCR。定量 PCR 反应体系为 10 μL 2× SYBR Green Pro Taq HS Premix、1 μL 引物 (10 μmol/L)、2 μL cDNA、0.4 μL ROX Reference Dye，并加入 ddH2O 至 20 μL。反应程序：1) 95℃ 预变性 10 min；2)扩增阶段，95℃变性 10 s，58℃ 退火+延伸 45 s，40 个循环；3)溶解曲线阶段，95℃ 变性 15 s，60℃ 1 min。其中每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复。定量PCR引物序列见表1。数据分析方法：用拟南芥内参基因actin作为相对定量的标准，表达分析使用2–ΔΔCT法，方法如下：

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of the real-time fluorescent quantitative PCR

1) 待测样品△CT=待测样品 CT(gene)–待测样品CT(actin)；

2)对照样品△CT=对照样本CT(gene)–对照样品CT(actin)；

3) △△CT=待测样品△CT–对照样品△CT。

1.8 转VvPHR1基因拟南芥的表型观察及磷含量测定

将野生型(WT)、T3代转基因型(OEPHR1)、突变体(phr1)以及突变体回补转基因型(phr1-VvPHR1)拟南芥种子用75%乙醇消毒5 min，30% NaClO消毒2 min，75%乙醇消毒2 min，再用无菌蒸馏水洗涤5次，然后将种子铺在1/2MS固体培养基上，置于4℃黑暗环境春化处理2天后，放于光照培养箱生长7天左右，将在1/2MS固体培养基上生长的拟南芥移至正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1 μmol/L Pi)的MS固体培养基上生长30天，拍照记录表型，取样保存，用于后续试验测定。全磷含量测定采用钼锑抗比色法，无机磷含量测定参照郭贞慧[16]无机磷测定方法。

1.9 生物信息学分析及数据处理

利用 ProtParam 在线工具预测VvPHR1基因编码蛋白的分子量、等电点、蛋白质分子式和编码氨基酸组成；利用TMHMM Server v.2.0在线对VvPHR蛋白的跨膜结构进行分析，采用Netphos分析VvPHR蛋白的激酶磷酸化位点；利用SOPMA在线工具对VvPHR1蛋白进行二级结构预测。使用MEGA-X软件来构建系统发育进化树，分析毛叶苕子和其他PHR基因家族成员之间的系统进化关系。用 Excel 2019 软件进行数据计算和图表制作。用Origin 2022 进行柱状图绘制。采用 SPSS 软件进行方差分析，采用 Duncan 氏新复极差法进行多重比较，不同字母表示 P<0.05，即差异显著。

2 结果与分析

2.1 毛叶苕子PHR1基因的组织特异性表达分析

在毛叶苕子转录组中共筛选到13个磷酸盐饥饿响应因子 PHR (phosphate starvation response)基因，与拟南芥和苜蓿等PHR1序列相似性最高的是转录本129590、转录本96227和转录本120424，其中转录本120424在根系和地上部表达量均最高(表2)，且该基因在正常磷水平下表达量较低，而在低磷水平下表达量较高，在毛叶苕子测序的两个品种的地上部和根部中均有体现(图3)，该转录本可能是毛叶苕子磷饥饿响应关键基因。

表2 磷饥饿响应相关基因的筛选Table 2 Screening for phosphate starvation response related genes

2.2 VvPHR1基因的生物信息学分析

毛叶苕子转录本120424的cDNA序列全长1008 bp，编码335个氨基酸(图4)。依据生物信息学分析，推测该基因无跨膜结构，可能定位于细胞核中，编码蛋白的分子量为36.5 KD，等电点为6.04，存在54个激酶磷酸化位点，其中包括41个Serine(丝氨酸)、11 个 Threonine (苏氨酸)和 2 个 Tyrosine(酪氨酸)位点；编码蛋白的二级结构含有20.90%的α-螺旋、70.15%的无规则卷曲、7.16%的延伸链和1.79%的β-转角。用该转录本序列与拟南芥、水稻和玉米等植物PHR基因做系统进化树分析发现，该基因与蒺藜苜蓿和大豆的PHR1亲缘关系较近(图5)。基于生物信息学预测及系统进化树分析，将毛叶苕子转录本120424命名为VvPHR1。

图4 VvPHR1基因序列Fig. 4 Sequence of VvPHR1 gene

图5 VvPHR1基因系统发育树分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of VvPHR1 gene

2.3 VvPHR1基因的转录自激活功能验证

利用酵母单杂交系统验证VvPHR1基因的转录自激活功能。结果显示，带有pGBKT7-VvPHR1融合载体的酵母菌在 SD/−Trp、SD/−Trp/−His 和SD/−Trp/−His/Ade的培养基上都能正常生长，并且能够使X-α-gal染料显示蓝色，然而含有pGBKT7空载的酵母菌只能在SD/−Trp上生长(图6)，上述结果表明VvPHR1在酵母细胞中具有转录激活活性。

图6 VvPHR1基因的转录自激活验证Fig. 6 Transcriptional activation of VvPHR1 gene

2.4 VvPHR1基因的亚细胞定位分析

将构建好的重组质粒分别转入烟草细胞和水稻原生质体中，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，在烟草细胞中VvPHR1-GFP融合蛋白与蓝色核标记物融合为青色，共定位于细胞核中(图7A)；在水稻原生质体中，更清楚地看到VvPHR1-GFP融合蛋白在细胞核中发出绿色荧光的区域，与D53核定位Marker标记为红色的区域融合成了明显的黄色(图7B)，上述试验结果表明毛叶苕子VvPHR1基因定位在细胞核中。

图7 VvPHR1基因亚细胞定位Fig. 7 Subcellular localization of VvPHR1 gene

2.5 转VvPHR1基因拟南芥中PHR、PHT基因表达特征

采用实时荧光定量PCR分析野生型(WT)和超表达型 (OEPHR1)拟南芥在 1 mmol/L Pi和 1 μmol/L Pi培养基处理30天后，VvPHR1、IPS1和磷转运蛋白基因AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9的表达。结果显示，野生型中未检测到VvPHR1基因的表达，在OEPHR1拟南芥中，与正常磷处理相比，低磷处理下VvPHR1基因显著上调表达(图8A)。进一步分析PHR1基因调控的下游磷转运蛋白基因的表达情况，结果表明与野生型拟南芥相比，在低磷处理下，OEPHR1拟南芥中的低磷诱导基因IPS1表达没有显著差异，而磷转运蛋白相关基因AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9 表达均显著上升，其中AtPHT1;1磷转运基因上调表达量最高 (图 8B)。

图8 转基因拟南芥中VvPHR1及磷酸盐转运体的相对表达量Fig. 8 Relative expression of VvPHR1 and phosphate transporters in transgenic Arabidopsis thaliana

2.6 转VvPHR1基因拟南芥的表型及磷含量分析

在正常磷培养基中，生长7天及30天的野生型(WT)与转VvPHR1基因型(OEPHR1)，突变体(Atphr1)与突变体回补型(Atphr1-VvPHR1)拟南芥鲜重、主根长、全磷及无机磷含量无显著差异(图9a、c、e、g和图10)。而在低磷培养基中，OEPHR1型拟南芥鲜重、主根长、全磷及无机磷含量较野生型(wild type, WT)型显著增加 (图 9b、f和图 10)；Atphr1-VvPHR型拟南芥鲜重、主根长、全磷及无机磷含量较Atphr1型显著增加(图9d、h和图10)，同时正常磷处理下WT和OEPHR1型拟南芥全磷含量和鲜重显著高于Atphr1型和Atphr1-VvPHR1型。

图9 不同磷处理下转VvPHR1基因拟南芥的表型Fig. 9 The phenotype of VvPHR1 transgenic Arabidopsis thaliana under different Pi treatments

图10 不同磷处理下转VvPHR1基因拟南芥主根长、鲜重及磷含量Fig. 10 Main root length, fresh weight, and Pi content of VvPHR1 transgenic Arabidopsis thaliana under different Pi treatments

3 讨论

植物PHR基因是响应低磷环境的关键转录因子之一，在磷信号传导中起着十分重要的作用。在拟南芥、水稻等模式植物研究发现，PHR基因家族形成一个调控网络，每个基因成员在调控缺磷信号和维持体内磷稳态中分别起着不同的作用[17–24]，其中PHR1是主要调控因子，在植物生长发育、响应低磷环境和信号转导等过程中发挥重要作用[14, 25–28]。在本研究中，毛叶苕子转录组中有13个PHR基因，转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高，其中转录本120424在低磷诱导下根系和地上部表达量均最高。该转录本cDNA全长1008 bp，编码蛋白的二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主，且为不稳定的非分泌蛋白，具有亲水性，没有信号肽和跨膜区域，其二级结构与拟南芥、水稻PHR1基因编码蛋白的结构具有相似性[19]。同源比对分析发现毛叶苕子转录本120424与拟南芥的PHR1亲缘关系较近，序列相似性93.7% (表2)。系统进化树分析表明，该基因与蒺藜苜蓿和大豆的PHR1亲缘关系较近(图5)，基于生物信息学预测及系统进化树分析，将毛叶苕子转录本120424命名为VvPHR1。

通常植物转录因子是定位在细胞核中，与下游目标基因5' 端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达[29–34]。本研究中，亚细胞定位结果显示毛叶苕子VvPHR1基因定位在细胞核中(图7)，与拟南芥和水稻等模式植物PHR基因的亚细胞定位结果一致。PHR基因家族可以通过与下游目的基因启动子上的P1BS序列相结合，进而激活或抑制下游包括磷转运蛋白基因(PHT)在内的许多PSI基因的表达，从而提高植物抵抗低磷胁迫能力[35–36]。本研究中，酵母单杂试验表明VvPHR1基因具有转录自激活活性(图6)，与拟南芥和水稻等PHR1基因的特征相吻合[18–19]。实时荧光定量PCR结果显示，与野生型相比，低磷胁迫下转VvPHR1基因拟南芥中VvPHR1基因及其下游调控的磷转运蛋白基因的表达量均显著上调(图8A和B)。上述结果表明从毛叶苕子克隆到的这个基因属于PHR家族的一个转录因子[9, 37–38]，参与磷饥饿条件下的转录调控过程。

一直以来，植物PHR1基因是研究最多的响应低磷胁迫应答的调节因子，并被认为是保持植物磷稳态的主要转录因子之一。拟南芥的phr1突变体在低磷胁迫下表现为花青素积累缺失，叶片中磷含量降低，根/茎值减少等[39]。水稻中有2个拟南芥PHR1的同源基因OsPHR1和OsPHR2，这2个基因均定位于细胞核，通过调控Pi饥饿诱导基因的表达参与了磷饥饿信号通路。其中，OsPHR2过表达株系对低磷胁迫具有更高的敏感性，该基因能够在缺磷的环境下促进水稻根系伸长，根毛增多，使水稻磷酸盐含量增加[10]。本研究中，在低磷处理下，OEPHR1型和突变体回补型拟南芥较野生型和突变体拟南芥的长势略好，鲜重和主根长增加，且全磷和无机磷含量显著高于野生型和突变体拟南芥(图9和图10)。同时发现，低磷情况下Atphr1-VvPHR1突变体回补型植株表现出更高的敏感性，其主根长较突变体增加的长度比转VvPHR1基因型植株较野生型增加的长度更加明显(图9b、d、f和h)，这表明VvPHR1参与了Pi饥饿下植株根系构型的改变，而转VvPHR1基因型根系伸长不明显可能是出现了PHR基因功能冗余的现象。上述结果表明毛叶苕子VvPHR1基因具有能够在低磷胁迫下改变根系构型、提高植物体内磷含量的生物学功能。