海洋弧菌对青岛近岸浒苔暴发的响应研究❋

苏蒙帅，梁金昌，于淑贤，张晓华,2,3❋❋

(1.中国海洋大学海洋生命学院，深海圈层与地球系统前沿科学中心，山东 青岛 266003；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266237；3.中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003)

弧菌(Vibrio)属于变形菌门(Proteobacteria)γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)，是一种典型的海洋异养细菌，一般条件下占海洋总细菌的1%左右[1]。以往的研究显示，弧菌是一种机会主义细菌，当环境条件适宜时，会出现暴发性的增殖[2]，当营养缺乏或生存环境不适时，又能进入活的非可培养(Viable but nonculturable，VBNC)状态，增强自身对不利环境条件的抗性，从而等待适合其生存的环境条件[3-4]。Rubio-Portillo等[5]的研究显示，在地中海区域不同地理位置，附着于石珊瑚表面的弧菌群落结构也是不同的。可培养弧菌群落与珊瑚的健康状况有关，健康珊瑚表面的弧菌丰度是不健康珊瑚的5倍多。Thickman等[6]发现浮游植物来源的溶解有机物(Dissolved organic matter，DOM)显著地增加了总副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和致病性V.parahaemolyticus的丰度。Armada等[4]在长期实验中检测到了弧菌具有呼吸作用，证明弧菌可以在资源有限的条件下存活。弧菌可以在营养条件充足时暴发性增殖又能在环境条件不利时增强自身抗性的生存策略，使它们能够适应各种各样的海洋环境。研究这种独特的生存策略对了解海洋生物地球化学循环具有重要的意义。

2007年至今，中国黄海沿岸地区每年夏季都会暴发浒苔(Ulvaprolifera)绿潮，给当地的生态环境造成了影响，甚至演变成一种自然灾害[7]。作为黄海沿岸北部城市的青岛，每年夏季也会受到浒苔暴发的影响。浒苔暴发对海洋水质的影响是巨大的。浒苔暴发初期会大量吸收海水中的营养物质，例如氮、磷等营养盐[8]。浒苔消退时，会大量沉入海底进行有氧分解，消耗大量的氧气，释放出大量的营养物质等，导致水中的溶解氧含量下降，对需氧生物尤其是异养微生物的呼吸产生严重的影响[9]。因此，藻类暴发影响了海洋中相关区域DOM的含量和种类，而异养细菌又可以利用和转化相应的DOM，使其成分和生物活性等方面发生变化。浒苔等浮游植物与海洋微生物之间的这种相互作用，影响了海洋的生物地球化学循环。

关于浒苔等浮游植物与微生物群落之间关系的研究已有报道。例如Liang等[10]在进行实验室模拟培养时发现浒苔来源的DOM促进总细菌和弧菌丰度在24 h达到峰值，群落出现明显的演替规律。Wang等[11]发现有浒苔生长的海水池塘中黄杆菌丰度较高，弧菌丰度较低。Zhang等[12]的研究表明在有浒苔生长的海水中脱硫弧菌(Desulfovibrio)等细菌占主导地位。然而目前并没有针对浒苔暴发整个过程中海洋细菌群落结构动态变化的研究，尤其是缺乏对浒苔分解物响应最快的弧菌的研究。本研究拟在自然条件下对浒苔暴发前、中、后期弧菌群落进行研究。结合传统培养方法和分子生物学技术，对弧菌的丰度和群落组成进行研究，确定弧菌在此过程中的丰度变化趋势及其群落演替规律。另外，本研究还将对影响弧菌群落的环境因子进行分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集

根据历年青岛近岸浒苔暴发的情况，选取三个典型的浒苔暴发地点(见图1，栈桥ZQ、鲁迅公园LX、第二海水浴场EY)，于2017年4—8月进行了14次海水取样。其中EY站点为广阔沙滩，没有大型岩石和草木的覆盖，较易受到人类影响；ZQ站点受到人为设计的景点阻隔，兼有沙滩和岩石等；LX站点多为大型岩石和草木，受到人为影响较小。三个站点生态环境不同，在一定程度上可以作为青岛近岸的代表，且均无城市废水排放管道等明显的非自然因素影响。取样时间涵盖本次浒苔暴发的全过程，可分为暴发前、中、后三个时间段。在采水现场使用200 μm孔径的筛绢预过滤海水，以除去颗粒较大的杂质。将滤过的海水通过漏斗转入5 L预先酸处理过的聚碳酸酯桶(Thermo Fisher Scientific，USA)中。用YSI多参数水质仪(YSI 556 MPS，美国)在现场测量海水的温度、盐度、电导率、总溶解性固体(TDS)、pH、溶解氧(DO)等理化指标。

(ZQ：栈桥；LX：鲁迅公园；EY：第二海水浴场。ZQ: Zhanqiao; LX: Luxun Park; EY: The Second Bathing Beach.)

样本用采样地点+采样月份+采样次数进行编号。其中：采样地点用其名称的前两个汉字首字母进行样品的命名；第一个数字表示采样的月份；第二个数字表示采样的次数。例如：LX41表示在鲁迅公园4月份的第一次采样。

根据本次浒苔来临和最后消退的时间，将样品分为三组：浒苔暴发前(Before，样品41、42、51、52、53、54、61)，浒苔暴发中(During，样品62、63、64、65、66、71、72)，浒苔消退后(After，样品73、74)。

1.2 样品预处理

DNA样品预处理：将1 L海水用3 μm孔径的聚碳酸酯膜(Millipore Corporation，Billerica，MA，直径47 mm；PC膜)过滤，再将过滤后的海水用0.22 μm孔径的PC膜过滤。使用后的滤膜均放入2 mL无菌冻存管，然后立刻放入液氮中速冻并转入-80 ℃冰箱保存。具体方法参照Liang等[10]的方法。

溶解有机碳(Dissolved organic carbon, DOC)样品预处理：将100 mL水样用预处理(酸洗，550 ℃灼烧6 h)过的专用过滤器过滤至玻璃纤维膜(Whatman，0.7 μm，5 mm)上。取过滤后水样大约40 mL至棕色玻璃瓶，为防止微生物干扰加一滴饱和HgCl2溶液。迅速放于-20 ℃保存。具体方法参照Zhang等[34]的方法。

叶绿素样品预处理：样品处理须在黑暗中进行，必须在2 h内完成。将500 mL水样于黑暗中用3 μm聚碳酸酯膜进行过滤，过滤后的水样再用0.22 μm膜进行过滤。将滤膜放入锡箔纸包裹的2 mL冻存管并放入液氮速冻，然后转入-80 ℃保存。具体方法参照《中华人民共和国国家标准》GB17378.4—1998。

1.3 环境因子的测定

溶解有机碳(DOC)：溶解有机碳的测定由中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室王旭晨教授课题组协助。采用高温催化氧化法通过岛津TOC-V全有机碳分析仪(日本京都岛津公司)测定[15]。

叶绿素：测定标准参照《中华人民共和国国家标准》GB17378.4—1998。过滤完海水的3和0.22 μm的聚碳酸酯膜分别加入80%的丙酮(10 mL)，混匀后在4 ℃放置14～24 h。使用荧光分光光度计测量酸化前后的荧光值。Chla的浓度计算参考以下公式：

式中：FD为换算因子；R为酸化因子；Rb为酸化前荧光值；Ra为酸化后荧光值；v为丙酮体积(mL)；V为海水体积(L)。

1.4 可培养弧菌丰度的测定

将海水样品梯度稀释后，涂布于TCBS培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)上，每个梯度设3个平行，于28 ℃培养48 h后进行计数。

1.5 DNA的提取

样品DNA的提取采用酚/氯仿/异戊醇法。具体方法：将滤膜放于冰上融化，剪碎后放入2 mL样品管中。加入600 μL sodium chlorideTris-EDTA(STE)溶液并用均质破碎仪震荡(6 m/s，60 s，3次)，加速裂解。加入10 μL的10 mg/mL溶菌酶并37 ℃水浴0.5 h，加入60 μL 10%的SDS溶液混匀，再加入6 μL 10 mg/mL蛋白酶并65 ℃水浴20 min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)离心(12 000 r/min，10 min)，再吸取上清加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)离心(12 000 r/min，10 min)并重复2次。上清用0.6倍体积异丙醇在-20 ℃沉降2 h或过夜，再次离心(14 000 r/min，4 ℃，10 min)。用70%乙醇冲洗离心管内壁后晾干。用无菌蒸馏水或Tris-EDTA(TE)溶解DNA，-20 ℃保存。

1.6 弧菌和细菌16SrRNA基因丰度的测定

样品中的弧菌和细菌16S rRNA基因丰度的定量，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)技术。所用引物序列见表1。

表1 本研究所用的PCR引物序列

反应参数、反应体系和标准品的制备参考Liang等的方法[19]。将标准菌接入含有Ampicillin抗性的LB培养基(Luria-Bertani培养基)，37 ℃恒温培养12 h。用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit Ⅰ(Takara)提取含有目的基因的质粒。用限制性内切酶XbaⅠ对质粒进行酶切，切胶回收后获得qPCR标准品。用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific，USA)测标准品浓度。

样品(包括标准品)设置3个平行，以无菌去离子水为模板设置三个空白对照。实验操作系统StepOne Real-time PCR System，分析软件StepOne(version2.2)。

1.7 弧菌16S rRNA基因高通量测序

DNA样品送往上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，对弧菌16S rRNA基因的V2～V4高变区扩增。测序平台Illumina MiSeq，扩增引物为169F和680R。所用引物序列见表1，反应参数、反应体系参考Liang等[19]的方法。

1.8 数据分析

将原始数据按最小样品序列数进行抽平，保留序列数总和≥3的物种。运用QIIME1软件过滤低质量序列和去除嵌合体，获得有效序列，使用UPARSE(v7.1)对序列进行OTU聚类，相似度为97%。通过RDP分类器算法对16S rRNA基因序列进行分类学分析，阈值为70%。对抽平后的样本重新命名，以便进行后续分析。进行Pan/Core物种分析，根据生成的曲线是否平缓，评估测序量是否足够。所有样品根据实验目的分组，设计分组方案。

按照浒苔暴发的不同时期进行分组。用非参数Mann-Whitney检验对环境因子进行显著性差异分析。通过Spearman秩和检验分析弧菌和细菌与环境因子的相关性。通过α多样性分析反映浒苔暴发过程中弧菌的多样性和丰富度。α多样性分析包括Phylogenetic distance、Chao 1、Shannon、Equitability四个指数，按照浒苔暴发的不同站点和暴发时期进行分组。利用非度量多维尺度(Non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析来探索组间群落组成的相似性或差异性。进行群落组成分析，通过Bar图可视化样本的物种丰度。通过Kruskal-Wallis秩和检验分析优势弧菌的丰度与环境因子的相关性。最后进行冗余分析研究弧菌群落与主控环境变量之间的关系。

2 结果

2.1 浒苔暴发和消亡期间的环境参数变化

(小写字母表示显著性差异分析，相同字母代表两者没有显著性差异，不同的字母代表有显著性差异。Lowercase letters represent significant difference analysis.The same letters represent no significant difference between the two, and different letters represent significant differences.)

2.2 可培养弧菌、总弧菌和总细菌丰度的变化

可培养弧菌与总弧菌的丰度随采样时间呈现逐渐增加的趋势，在7月的第二次采样(采样点72)时间点附近达到峰值，浒苔消退后略有下降(见图3A、B)。可培养弧菌丰度在浒苔暴发前先短暂下降，之后迅速上升，其平均值为76.17 CFU/mL，而在整个暴发过程中趋于稳定，约2 131.32 CFU/mL。总弧菌的丰度在浒苔暴发过程中变化趋势明显(2.65×103～1.71×106copies/mL)，在浒苔暴发前先短暂上升，再迅速下降，暴发前丰度为4.19×104copies/mL。在71采样时间点附近出现短暂的丰度减小(1.12×104copies/mL)，后迅速上升到最高值(8.09×105copies/mL)。因此，浒苔暴发对总弧菌群落的影响主要发生在暴发末期。可能是由于浒苔裂解导致营养物质迅速释放，为弧菌生长提供了营养条件。

总细菌的丰度在浒苔暴发过程中变化趋势较为稳定，呈现缓慢下降的趋势(见图3C)，并介于3.38×105和1.58×107copies/mL之间。浒苔消退后，总细菌的丰度达到最低值1.32×106copies/mL。在总弧菌丰度显著上升的情况下，总细菌丰度却无明显变化，这使弧菌在细菌中的占比从小于1%上升至20.54%，表明浒苔暴发的确影响了弧菌群落的丰度，造成了细菌群落的演替，弧菌代替其他类群成为了重要组成。浒苔消退后，弧菌的丰度又恢复到暴发前水平，表明群落演替再次发生。

对三个采样点的可培养弧菌、总弧菌、总细菌比较分析发现，在大多数的采样时间点，ZQ的丰度总是最高的。EY和LX在弧菌与细菌的丰度上无显著性差异。在弧菌丰度达到峰值时(72采样点)，EY与ZQ的丰度高于LX，两者差别很小。

(A：可培养弧菌；B：总弧菌；C：总细菌；D：丰度与环境因子的关系。Spearman秩和检验。Vibrio-F、Vibrio-P分别为自由生活和附着生活的弧菌；Bacteria-F、Bacteria-P分别为自由生活和附着生活的细菌；Cultural为可培养弧菌。*：P<0.05; **：P<0.01；***：P<0.001。椭圆向左为负相关，向右为正相关。A: Culturable Vibrio; B: Total Vibrio; C: Total bacteria; D: Relationship between abundance and environmental factors.Spearman’s rank correlation test.“Vibrio-F” and “Vibrio-P” are free-living and particle-associated Vibrio respectively, “Bacteria-F” and “Bacteria-P” are free-living and particle-associated Bacteria respectively, and “Cultural” is culturable Vibrio.*：P < 0.05; **：P < 0.01; ***：P < 0.001.The ellipse has a negative correlation to the left and a positive correlation to the right.)

2.3 弧菌群落结构的变化及其影响因素分析

2.3.1 弧菌的多样性和丰富度 48个样品共获得1 836 819条序列，抽平后每个样品获得21 781条序列。样品的coverage均在99.9%以上，可以确定这些序列能够代表所有样品中的弧菌。将样品按照浒苔暴发的时间和采样站位进行分组，可看出浒苔暴发与弧菌丰富度无显著相关性(见图4A、B)，但是暴发前后的均匀度与多样性指数有显著差异(t检验，P<0.05，见图4C、D、G和H)。从站位方面看，ZQ站点的丰富度和系统发育距离明显高于其余两个站点(P<0.05，见图4E、F)。

图4 浒苔暴发过程中弧菌的多样性和丰富度指数变化

基于OTU水平进行NMDS分析，弧菌按照浒苔暴发前、暴发时、消退后沿第一轴进行聚类(见图5，Stress=0.148)，根据采样站点没有明显的聚类。表明浒苔暴发极大地影响了弧菌的群落组成，造成群落间显著差异(ANOSIM，R2=0.43，P<0.001)。

(用不同的颜色区分浒苔暴发时期，用不同的形状区分不同样品地点。Samples of different periods of Ulva prolifera bloom are color-coded and samples of different sampling sites are distinguished by shapes.)

2.3.2 弧菌的群落分析 浒苔暴发过程中弧菌群落组成发生显著变化(见图6、7A)。对弧菌群落中优势种分析结果显示，V.splendidus(P<0.001)、V.gigantis(P<0.001)和V.pectenicida(P<0.05)随采样时间延长呈现降低趋势，浒苔暴发前、后的占比存在显著差异。其中V.splendidus是弧菌群落中丰度最高的种，浒苔暴发前丰度为76.40%。V.campbellii(P<0.001)、V.caribbeanicus(P<0.01)和V.maritimus(P<0.01)随采样时间延长丰度不断升高。其中V.campbellii在浒苔消退后在弧菌群落中占比最高。V.comitans(P<0.01)、Photobacteriumrosenbergii(P<0.05)和V.pelagius(P<0.001)在浒苔暴发时占比最高，消退后略有下降。

图6 浒苔暴发过程中的弧菌群落组成

(A：部分优势弧菌类群在不同阶段的占比，图中只展示有显著性差异的物种，Kruskal-Wallis秩和检验，*：P<0.05; **：P<0.01；***：P<0.001。B：弧菌丰度与环境因子的关系。A: Proportion of some dominant Vibrio groups in different stages, only species with significant differences are shown，Kruskal Wallis rank sum test，*：P<0.05; **：P<0.01; ***：P<0.001.B: Relationship between Vibrio abundance and environmental factors.)

图8 冗余分析说明弧菌群落与主控环境变量之间的关系

3 讨论

3.1 浒苔暴发对弧菌丰度的影响

先前的研究表明，弧菌是一种典型的机会主义细菌，当环境条件适宜时，会发生暴发性的增殖[20]。尤其一些浮游动植物的暴发会紧跟着弧菌的暴发增殖。例如，Thickman等[6]发现浮游植物来源的DOM显著地增加了总V.parahaemolyticus和致病性V.parahaemolyticus的丰度。Sison-Mangus等[21]发现随着拟菱形藻暴发进入峰值，弧菌的丰度从6%增加到65%，且其丰度与浮游植物生物量呈现正相关。Main等[22]发现附着生活的弧菌同赤潮异弯藻、甲藻的丰度显著正相关。同样的在本次研究中，浒苔暴发期总弧菌与可培养弧菌丰度均出现显著性升高。尤其是在浒苔暴发末期(71～72)，弧菌丰度从1.12×104copies/mL迅速增加至8.09×105copies/mL，总弧菌对细菌的占比也从不到1%增加到11.3%左右。以往的研究可知，弧菌具有较短的代时，例如需钠弧菌(V.natriegens)的代时低于10 min[23]，这可能与弧菌有较高的核糖体基因拷贝数有关，能够较快地进行增殖[24]。另外，弧菌能够在营养物质匮乏的情况下生存，这与它们对有机碳化合物代谢谱广有关。它们可以通过分泌一系列的胞外酶而去利用很多大分子的有机物例如褐藻胶等，还可以直接利用很多小分子物质[25]。同时，弧菌通过自身的趋化作用寻找营养物质，一旦其生长的某种限制因子得到补充，又可以暴发性增殖[26-27]。

在浒苔暴发整个过程中，相比于暴发前期弧菌丰度的略微升高，暴发末期，丰度显著性升高，推测这与暴发末期浒苔大量裂解而导致的营养物质大量释放有关。Liu等[28]的研究表明，浒苔上附着生活着很多细菌，其中弧菌是优势类群之一。因此，浒苔暴发过程中，由于其丰度的迅速增加，为附着生活的弧菌提供了足够多的生态位。暴发末期，浒苔大量裂解[12]，释放出大量的营养物质如氮、磷等营养盐，同时释放出大量的DOM。这些DOM大多由浒苔多糖和蛋白质组成，其中小分子DOM被细菌直接利用，大分子DOM在细菌分泌的胞外酶作用下降解为小分子再被利用。因此附着生活的弧菌转变为自由生活状态，利用这些营养物质迅速增殖。以往的研究证实了这样的结果，Liu等[28]在对青岛胶州湾浒苔暴发所引起的细菌群落改变的研究中发现，藻类暴发末期甚至开始消退时弧菌目对总细菌相对占比达到最大。Teeling等[29]关于海洋中浮游植物繁殖对浮游细菌的群落演替的研究中发现，直到浮游植物暴发的消退期，γ变形菌纲的细菌如弧菌的丰度才开始迅猛增加。因此可以得出结论：浒苔等藻类对弧菌丰度的影响主要集中在暴发的末期，也可能是由于暴发末期是浮游植物死亡释放大量营养物质的时期。

3.2 浒苔暴发对弧菌群落的影响

Diner等[33]在美国南加州圣迭戈长达一年的时间里每月对霍乱弧菌(V.cholerae)，V.parahaemolyticus，创伤弧菌(V.vulnificus)进行监测，发现它们的丰度都很高，但是特定物种分布对应于特定的温度和盐度。本次研究也能得出多种弧菌与温度呈现显著相关性。例如，夏季海水温度升高了15 ℃，随着浒苔暴发，弧菌群落的优势种发生很大的变化。浒苔暴发前期，占比最大的是V.splendidus，其相对丰度高达76.40%。随着采样时间的增加，温度逐渐变高，V.splendidus却呈现一种减小的趋势。而V.campbellii相反，随着温度的升高而增加，并成为暴发后期的主要类群。同样的，V.gigantis随水温升高而降低，V.caribbeanicus随水温升高而增加。Liang等[19]在之前的研究中发现，中国北部边缘海的V.campbellii和V.caribbeanicus在夏季的丰度大于水温较低的冬季，本研究结果同该结论一致，即在浒苔暴发过程中以V.campbellii和V.caribbeanicus为代表的温水物种逐渐成为弧菌群落的优势类群。

3.3 关于DOM与弧菌群落的关系

4 结语