清胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠肾脏AQP4 蛋白表达及肾功能的影响

杨元生，叶东雯，彭卫斌，陈垦，谢文瑞，容海鹰

（1.广州新海医院，广东广州 510300；2.广东药科大学临床药学院，广东广州 510310；3.广东药科大学附属第一医院，广东广州 510800）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是以炎症反应和胰腺自身消化为主要特征的临床常见急腹症，临床诊治不及时可进展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）合并远处脏器损害，SAP 约占AP 的10%～20%，起病凶险，早期脏器功能损害以肝（76.4%）、肺（72.7%）和肾（45.5%）最多，尽管目前医疗水平提高后SAP 病死率有所下降，但仍高达10%[1-2]。因此，探讨有效治疗药物是降低SAP 病死率的迫切需要。本课题组于2007 年由陈垦教授主持广东省课题研制中药复方清胰颗粒，清胰颗粒含大黄、丹参、芒硝、赤芍等多味药材按一定比例组成，由广东康诚堂医药科技有限公司提供，每克含生药6.15 g。药材购自广州采芝林药业连锁店，均经广东药科大学中药学院李书渊教授鉴定。本方依据大承气汤组方[3]优化成清胰汤，后经过多年药物制剂实验调制研究开发成固体颗粒剂型，随后多年进行了动物毒理学和药理学实验研究，包括清胰颗粒对NF-κB 炎症通路及氧化应激等的作用，结果证实清胰颗粒可有效治疗SAP，且无明显毒副作用[4-5]。水通道蛋白4（aquaporin protein 4,AQP4）为分布广泛并参与水及甘油等小分子转运的膜通道蛋白，具有多种生物学效应。研究显示AQP4 表达改变可影响重要器官水代谢平衡，严重影响器官功能[6]。本课题所用清胰颗粒由陈垦教授赠予，本研究拟通过探讨AQP4在SAP大鼠肾脏组织中表达变化对肾功能的影响，从而明确QYG 治疗SAP 肾损伤大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，雌雄不限，体质量250～300 g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002。

1.2 主要试剂和仪器

AQP4多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-32739）；辣根过氧化物酶标记二抗（山羊抗兔，批号：bs-80295G-HRP）、β-actin（批号：bsm-33036M）、ECL 发光试剂盒（批号：C05-07004）和肾损伤因子试剂盒（Kim-1，批号：bsk11070）均购自博奥森公司；通用型SP-9000 试剂盒（北京中山金桥，批号：SP-9000）；白介素-6（IL-6，批号：bsm-10807M）和肿瘤坏死因子（TNF-α，批号：CME0004）ELISA 试剂盒均购自美国eBioscience 公司；牛黄胆酸钠（美国Sigma 公司，批号：T7515）；戊巴比妥钠（美国Sigma公司，批号：11715）；地塞米松（dexamethasone,DXMS，山东新华制药有限公司，批号：H37020291）；清胰颗粒（广东药科大学自备，规格：10 mg/包，每克含生药6.15 g）；HITACHI 全自动生化分析仪（日本日立公司）；Anthos2010 型酶标仪（Anthos tabtec instranents 公司）；Image-pro PLUS6.0 显微图像系统（Media Cybernetics公司）；切片机（徕卡RM2135）。

1.3 大鼠SAP肾损伤模型的建立

实验前SD 大鼠禁食不禁水12 h，以3%（φ）戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）腹腔内注射麻醉SD大鼠后固定于手术台，2%络合碘消毒。沿腹正中线开腹提取十二指肠，辨认出胰胆管及肝门部胆总管。找到十二指肠乳头开口，在其开口略偏下对侧系膜缘肠壁上选一无血管区，用5号注射器针头戳一小孔，置入预先备好拉细的硬膜外导管，向乳头开口方向逆行探入胰胆管内，逆行推进4～5 mm 后在胰胆管下段及其内导管一并缝扎关闭肝门部胆总管，以防止导管脱出及牛磺胆酸钠进入十二指肠和肝脏。导管末端接输液转换器，用微量泵逆行泵入5%STC（0.1 mL/100 g，0.2 mL/min），2～3 min后即可见胰腺充血、水肿、胰胆管及主胰管扩张。维持8～10 min后解除结扎，退出导管。按压肠壁穿刺孔1～2 min，将肠管复位，逐层关腹。假手术组（SO组）仅翻动十二指肠、胰腺后关腹。所有大鼠术后均于大腿外侧皮下补液（生理盐水2 mL/100 g），苏醒后禁食不禁水。SAP 并发肾损伤模型的鉴定：建模24 h 后取大鼠耳静脉血采用Kim-1 试剂盒检测血清Kim-1 水平，Kim-1水平≥正常大鼠3倍视为建模成功[4]。

1.4 分组与给药

SD大鼠64只，随机分SO组、SAP组、QYG组和DXMS 组，每组16 只，SAP 组和QYG 组于造模前12 h 每只大鼠分别给予生理盐水（1 mL/100 mg）和QYG（1 mL/100 mg）灌胃，建模后禁食不禁饮，QYG组大鼠给予QYG 兑水1∶1（w∶w）灌胃（1 mL/100 g）每12 h 1次，DXMS组大鼠给予DXMS肌注（5 mg/kg），每天1次，SO组大鼠不予药物干预，分别于48 h和72 h 两个时间点心脏采血。

1.5 大鼠肾干湿质量比及其肾脏系数

称大鼠体质量后，心脏采血处死取左肾去除被膜，称其湿质量，后放入干燥箱中105 ℃烘干至恒重（2 次干质量之差＜0.2 mg），称其干质量，再测干质量/湿质量；大鼠肾脏系数=肾脏湿质量/大鼠体质量×100%。

1.6 血清AMS、Scr和BUN水平的检测

大鼠心脏采血2 mL，室温凝固2 h、低温低速（4 ℃，3 500 r/min）离心后取其上清液，-20 ℃保存。应用HITACHI全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中淀粉酶（AMS）、Scr和BUN不同时间点的变化水平。

1.7 血清IL-6和TNF-α水平的检测

大鼠全血处理方法同上，按IL-6 和TNF-αElisa试剂盒操作步骤测大鼠血清IL-6 和TNF-α的表达水平，各指标重复1 次，取均值统计分析，观察各组大鼠不同时间点炎症因子的变化趋势及其相关性。

1.8 大鼠肾脏组织病理观察

取大鼠右肾组织，用10%（φ）甲醛过夜固定、脱水、石蜡包埋，病理切片（厚度为4 μm），HE 染色后，晾干封片，光镜下按肾脏组织中炎性细胞浸润、充血水肿和组织出血及细胞坏死3个维度各自面积百分比打分（正常：0分，0＜10%：1分，10%～25%：2分，25%～50%：3 分，50%～75%：4 分，＞75%：5 分）对肾脏组织病理进行双盲评分[7]。

1.9 肾脏AQP4蛋白的检测

1.9.1 免疫组化法定性检测 取肾脏组织切片，常规融蜡、脱蜡、脱水，按中山金桥SP-9000 免疫组化试剂盒步骤操作，一抗AQP4（1∶50），DAB试剂盒显色，晾干、封片，着色细胞为AQP4 表达阳性。阴性对照用磷酸盐缓冲液（PBS）替代一抗。光镜下按阳性细胞百分率：＜10%为（-），10%～25%为（+），25%～50%为（++），＞50%为（+++）；染色强度：基本不着色为（-），淡黄色为（+），黄色为（++），棕黄色为（+++），对肾脏组织免疫组化结果进行双盲评分。

1.9.2 Western blot法定量检测 取大鼠肾组织150 g，眼科剪剪碎移入匀浆器中，加入655 μL 组织裂解液和38 μL PMFS 混合匀浆，冰上反应30 min，4 ℃12 000 r/min 离心10 min 后取上清液，按BCA 蛋白定量试剂盒方法制定标准曲线并计算出样品蛋白浓度，取50 μg 蛋白为上样量，6%浓缩胶和10%分离胶电泳分离蛋白质，半干胶电转移凝胶蛋白至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF 膜2 h，一抗AQP4（1∶300），室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，二抗（1∶8 000）室温孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次，按ECL 试剂盒方法发光，暗盒曝光、显影、定影，用Image-pro PLUS6.0 显微图像系统拍片分析图像灰度。内参β-actin（1∶700）Western blot 步骤同上。以上操作均重复2次。

1.10 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件进行分析，实验数据以表示。组间比较运用重复测量两因素多水平方差分析，配对资料t检验和多因素间相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾脏干湿质量比和肾脏系数

SAP 组大鼠的肾脏干湿质量比较SO 组下降，差异有统计学意义（P＜0.05），QYG 组、DXMS 组肾脏干湿质量比与SAP组比较差异有统计学意义（P＜0.05），SAP组大鼠肾脏系数较SO组增大（P＜0.05），QYG 组、DXMS 组大鼠肾脏系数与SAP 组比较减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肾脏干湿质量比和肾脏系数比较Table 1 Comparison of kidney dry wet weight ratio and kidney coefficient of rats in each group (，n=16)

表1 各组大鼠肾脏干湿质量比和肾脏系数比较Table 1 Comparison of kidney dry wet weight ratio and kidney coefficient of rats in each group (，n=16)

与SO组比较：*P＜0.05；与SAP组比较：△P＜0.05。

2.2 各组血清AMS、BUN和Scr结果比较

SAP大鼠血清AMS水平较SO组明显升高，72 h有所下降，但仍高于SO 组，SAP 组的各指标与SO组比较均具有统计学差异（表2，P＜0.05）。QYG、DXMS 治疗组各时间点峰值下降，72 h 下降显著（P＜0.05）。SAP 大鼠血清BUN 和Scr 含量均高于SO大鼠，经QYG和DXMS治疗后均有下降，72 h降低明显，DXMS 组效果优于QYG 组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清AMS、BUN和Scr水平比较Table 2 Comparison of serum AMS，BUN and Scr levels in rats of each group(，n=16)

表2 各组大鼠血清AMS、BUN和Scr水平比较Table 2 Comparison of serum AMS，BUN and Scr levels in rats of each group(，n=16)

与SO组比较：*P＜0.05；与DXMS组比较：▲P＜0.05；与SAP组比较：△P＜0.05。

2.3 各组血清IL-6和TNF-α含量比较.

血清IL-6 和TNF-α含量在SO 组大鼠各时间点均变化不大，但在SAP 大鼠中显著升高，IL-6 水平48 h 达到峰值，72 h 有所回落，而TNF-α则持续升高，与SO 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。经QYG 和DXMS干预后两指标均有下降，72 h效果明显，效果呈现时间依赖性，DXMS 组疗效优于QYG组，与SAP 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。血清IL-6 与TNF-α水平相关分析显示r=-0.032，P=0.952，结果提示IL-6与TNF-α表达无明显相关性。

表3 各组大鼠血清IL-6和TNF-α变化Table 3 Changes of serum IL-6 and TNF-α in rats of each group(，n=16) ρ（ng·L-1）

表3 各组大鼠血清IL-6和TNF-α变化Table 3 Changes of serum IL-6 and TNF-α in rats of each group(，n=16) ρ（ng·L-1）

与SO组比较：*P＜0.05；与DXMS组比较：▲P＜0.05；与SAP组比较：△P＜0.05。

2.4 肾脏病理结果

SO组大鼠肾脏无明显病理损伤，SAP组可见肾脏细胞充血水肿，炎性细胞浸润，甚至出血、坏死，部分肾脏结构模糊，并出现肾小球固缩现象，48 h病理改变明显；予QYG 和DXMS 治疗后SAP 大鼠肾脏的病理损伤减轻，病理评分下降，治疗72 h 改善明显，QYG 组效果略逊于DXMS 组，与SAP 组比较有统计学意义（图1）。SAP 组大鼠肾脏病理评分与其血清IL-6 与TNF-α水平相关分析呈正相关性（r=0.675，r=0.583）。

图1 大鼠72 h肾脏病理HE染色结果（200×）Figure 1 Pathological HE staining results of rat kidney at 72 h(200×)

2.5 肾脏AQP4蛋白免疫组化结果

免疫组化显示AQP4蛋白主要表达于近端肾小管和肾髓质部位，在SO 组2个时间点表达较少且变化不大，在SAP 大鼠则随时间推移AQP4 表达明显上调，48 h表达显著增多；经QYG和MXDS治疗后，AQP4 蛋白表达较同期SAP 组大鼠减少，72 h 下调明显（图2）。

图2 大鼠72 h肾脏AQP4免疫组化结果（IHC，40×）Figure 2 Immunohistochemical results of AQP4 in rat kidney at 72 h(IHC,40×)

2.6 肾脏AQP4免疫印迹结果

免疫印迹显示AQP4 蛋白在SO 组两个时间点表达量较少且相对稳定，在SAP组两个时间点表达量均明显增多，与SO 组比较有统计学差异（P＜0.05）；经QYG 和DXMS 干预后AQP4 表达下调，有时效性，72 h下降显著，DXMS组疗效优于QYG 组，但仍高于同期SO 组表达量（图3）。相关分析提示SAP组大鼠肾脏AQP4 蛋白表达量与血清TNF-α和IL-6水平呈正相关（r=0.764，r=0.784）。

图3 各组大鼠肾脏组织AQP4蛋白免疫印迹结果及免疫印迹评分统计图Figure 3 Immunoblotting result of AQP4 protein in kidney tissues of rats in each group

3 讨论

AP 为临床常见多发急腹症，约有10%～20%可进展为SAP，并发多器官损害，如肝、肺和肾等，SAP并发肾损伤的发生率为45.5%[1]，导致肾损害的机制目前尚未明确，可能与多因素有关。肾脏是机体排泄代谢毒物最重要的器官，SAP 时有效血容量减少、过度炎症反应和氧化应激可直接致肾损伤，重者肾衰竭危及生命。研究显示TNF-α和氧自由基（0FR）对肾脏有直接毒性作用[8]。前期研究显示5%STC 诱导大鼠SAP 易并发肝肾损伤[4]，本研究发现SAP 大鼠血清AMS、Scr 和BUN 显著升高，肾脏干湿质量比下降，肾脏系数减小，肾脏病理损伤明显，提示本实验构建的SAP 肾损伤模型成功。深入分析发现SAP 大鼠早期血清TNF-α和IL-6 即升高，但相关分析显示血清TNF-α和IL-6与肾脏病理损伤评分呈正相关，提示SAP 大鼠爆发严重的炎症反应参与触发SIRS和多器官功能障碍综合征（MODS）。

TNF-α诱导IL-l、IL-6、内皮素-1（ET-1）表达增多，增加肾血管通透性，使IL-1 和IL-6 渗入组织间隙，ET-1 强烈收缩肾血管，不利于炎症因子的清除。研究显示SAP 大鼠肾组织中TNF-αmRNA 表达明显升高，提示TNF-α可能在SAP 并发肾损伤中具有重要作用[7，9]。中药可改善脏器微循环，减少ET 分泌入血、增加血流，有利于清除炎症介质，从而改善SAP 引起的肾损伤[3-4，10]。尽早用中药干预SAP 可保护肠道屏障和抑制炎症反应从而减轻SAP 的严重程度[11-12]。清胰汤可明显降低SAP 患者血中TNF-α、IL-6、IL-8 浓度和提高免疫功能从而显著改善患者的预后[12]。DXMS 能有效抑制机体炎症反应，减少炎症因子释放和改善肾脏血流[13]。本研究发现SAP大鼠经QYG和DXMS治疗后，血清AMS、TNF-α、IL-6、Scr和BUN水平有所下降，干预48 h所有指标下降明显，72 h 更显著，结果表明QYG 可有效减轻SAP大鼠的炎症反应和肾损伤，QYG护肾效果呈时效依赖性，但QYG 组疗效稍逊于DXMS 组。综上，清胰颗粒通过抑制SAP 大鼠的炎症反应可有效保护其肾功能并改善SAP病情。

AQPs 在全身许多器官均有表达，肾脏表达AQPs蛋白可能参与体液成分的急性或慢性调节[14]。AQP4是AQPs蛋白家族成员之一，主要表达于肾脏远曲小管和集合小管上皮基底外侧膜，与AQP3 一起对集合管上皮顶质膜AQP2重吸收的水分起扩散和渗透作用[15]。研究发现TNF-α信号通过肿瘤坏死因子受体-1（TNFR1）路径介导上调AQP4[16]；重组IL-1 可使培养的星形胶质细胞AQP4 表达增加，但其诱导效应呈浓度和时间依赖性，抑制NF-κB 通路可阻断IL-1 浓度依赖性AQP4 表达[17]。抑制大脑炎症反应，下调IL-6水平，可降低AQP4表达[18]。AQP4 上调使水分子更易弥散入肾脏组织间隙，加重肾脏水肿和功能损伤。本研究显示SAP 大鼠血清TNF-α和IL-6 浓度升高与肾脏组织中AQP4 蛋白表达量均呈正相关，提示TNF-α和IL-6 可上调AQP4 表达。据报道大黄能抑制胰腺炎大鼠的炎症反应、清除自由基和减少肠道毒素吸收从而减轻器官损伤和改善临床症状[19]，研究显示大黄可抑制大鼠肾脏AQP2 和AQP4 蛋白及其mRNA 表达，下调AQPs 表达引起多尿、烦渴[20]。本研究显示SAP大鼠经QYG 和DXMS 干预后血清TNF-α和IL-6 含量下降，肾组织中AQP4 蛋白表达量减少，血清BUN 和Scr 水平降低，肾脏病理损伤减轻，肾干湿质量比升高，证实QYG 和DXMS 均可有效保护SAP 肾脏。

综上所述，本实验发现，SAP 大鼠血清TNF-α和IL-6 水平和肾脏AQP4 表达量在早期即升高，TNF-α和IL-6 明确参与肾损伤。可见，AQP4 参与SAP 并发肾损伤病理生理过程。SAP 大鼠经QYG和DXMS 干预后大鼠血清TNF-α、IL-6、BUN 和Scr含量下降，肾脏AQP4表达量减少，水重吸收和弥散改善，肾脏病理损伤减轻，二者均有保护肾脏作用。推测QYG 可能通过抑制炎症因子TNF-α、IL-6 表达使肾脏AQP4 表达下调从而起到保护肾脏作用，其分子机制还需进一步深入探讨。