基于多指标含量测定结合化学计量学评价的石见穿质量研究

梁慧，陶晨璐，刘艳梅，彭致铖，潘礼业，朱德全，丁青

（广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244）

石见穿为唇形科植物华鼠尾草（Salvia chinensisBenth.）的干燥地上部分[1]，具有清热解毒、活血止痛的功效，原植物主要分布在山东、江苏南部、安徽南部、浙江、湖北、广东北部、广西东北部、四川等地[2]。现代中医临床研究表明，石见穿对妇科疾病、各类炎症及多种癌症有良好疗效[3]。石见穿在临床上常以汤剂形式使用，汤剂以水溶性成分为主。黄雯洁等[4]对石见穿水提物进行质谱分析，发现其中含有大量酚酸类成分，包括丹参素、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C等。酚酸类物质具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种药理活性[5]，与石见穿清热解毒的功效相关，为石见穿的主要活性成分之一。石见穿中的酚酸类物质较多，目前已有研究针对其中的迷迭香酸、丹酚酸B、丹参素建立含量测定方法[6-9]，但多采用HPLC法，且检测指标较少，亦未对不同产地的样品进行深入统计分析。近年来，聚类热图、灰色关联度分析与熵权TOPSIS 分析作为新型的统计分析工具被广泛应用于中药研究领域。与传统的系统聚类相比，聚类热图分析不仅可对样品进行分类，还可结合热图更直观了解到数据的分布。灰色关联度分析可较好的反映数据间的非线性关系[10]，具有样本要求低、计算量小的优点[11]，其“灰色系统理论”与中医药理论思想相契合，为中药材的质量评价提供了新思路。熵权TOPSIS 分析法是一种常用的组内综合评价方法，能充分利用原始数据的信息，精确地反映各评价方案之间的差距。其方案属性与效用之间呈线性变化关系[10]，与灰色关联度分析相互验证能更客观地评价中药材质量。

本研究收集了来自广东、广西、山东、安徽、湖北5 个产地共20 批药材，采用UPLC 技术建立了快速测定石见穿中5 种酚酸类成分的含量测定方法，同时参照2020 年版《中国药典》测定其水溶性浸出物，引入近年热门的聚类热图、灰色关联度分析与熵权TOPSIS 分析综合评价不同产地石见穿药材的质量，以期为石见穿药材质量标准研究及资源利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Vanquish 型超高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；Waters H-Class 型超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ME204E 型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；XP26 型百万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（默克股份有限公司）。

1.2 材料

丹酚酸B 对照品（批号：111562-201917，纯度96.6%）、丹参素钠对照品（批号：110855-201915，纯度97.8%）、咖啡酸对照品（批号：110885-201703，纯度99.7%）、绿原酸对照品（批号：110753-202018，纯度96.1%）、迷迭香酸对照品（批号：111871-202007，纯度98.1%）均购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（德国默克公司）为色谱纯，甲醇（西陇科学股份有限公司）为分析纯。20 批石见穿药材样品采购自广东、广西、山东、安徽、湖北5 个产地，经广东一方制药有限公司孙冬梅教授鉴定，均为唇形科植物华鼠尾草（Salvia chinensisBenth.）的干燥地上部分，具体信息见表1。

表1 20批石见穿药材来源信息Table 1 Source information of 20 batches of Salvia Chinensis

2 方法

2.1 水溶性浸出物测定

参照《中国药典》2020 年版四部通则2201 项下水溶性浸出物测定法中的热浸法进行测定。

2.2 5种酚酸类成分测定

2.2.1 色谱条件 采用Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸（A）-乙腈（B）为流动相按表2中的洗脱梯度进行检测；检测波长为290 nm；柱温为40 ℃；流速为0.4 mL/min；进样量为1 μL。

表2 梯度洗脱表Table 2 Gradient elution procedure

2.2.2 对照品溶液制备 分别取咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加入体积分数为50%的甲醇分别制成每1 mL 含咖啡酸50 μg、绿原酸50 μg、迷迭香酸100 μg、丹酚酸B 50 μg的溶液，即得相应的对照品溶液；另取丹参素钠对照品适量，精密称定，加入体积分数为50%的甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液（相当于每1 mL含丹参素45 μg），即得丹参素对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取石见穿药材粉末（过三号筛）约1.0 g，精密称定，置50 mL 锥形瓶中，精密加入体积分数为50%的甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250W，频率40 kHz）30 分钟，放冷，再称定质量，用体积分数为50%的甲醇水溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性试验 精密吸取空白溶剂（体积分数为50%的甲醇）、“2.2.2”项下对照品溶液、“2.2.3”项下石见穿（编号SJC03）供试品溶液各1 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。如图1 所示，石见穿药材供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图在相同保留时间处有对应色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明建立的方法专属性良好。

图1 石见穿药材5种酚酸类成分含量测定专属性考察色谱图Figure 1 The chomatograms of specific test

2.2.4.2 线性关系考察 取丹参素钠、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 对照品适量，精密称定，置25 mL棕色量瓶中，加体积分数为50%的甲醇定容，制成每1 mL 含丹参素198.182 μg、咖啡酸40.961 μg、绿原酸40.304 μg、迷迭香酸196.828 μg、丹酚酸B 165.843 μg 的混合对照品母液；精密吸取混合对照品母液5、2.5、1.25、1、0.5、0.2 mL，分别置10 mL棕色量瓶中，加体积分数为50%的甲醇水溶液定容，制得系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液和混合对照品母液各1 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录各对照品峰面积。以峰面积为纵坐标、对照品的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，结果如表3所示。

表3 线性关系考察Table 3 Results of linear relationship investigation

2.2.4.3 精密度试验 取石见穿药材粉末（编号SJC03）约1.0 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算丹参素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 的峰面积RSD 分别为0.72%、0.40%、0.39%、0.42%、0.65%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.4 稳定性试验 取“2.2.4.3”精密度项下供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，计算丹参素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 的峰面积RSD 分别为0.81%、0.84%、0.79%、0.45%、0.92%，均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4.5 重复性试验 取石见穿药材粉末（编号SJC03）按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以外标法计算含量。结果，样品中丹参素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 的平均含量分别为0.810、0.056、0.148、0.495、1.315 mg/g，RSD分别为1.81%、0.66%、0.77%、0.62%、1.53%，均符合《中国药典》2020 年版四部9101“分析方法验证指导原则”中的规定，表明该分析方法重复性良好。

2.2.4.6 准确度考察 取丹参素纳5.000 mg、咖啡酸3.002 mg、绿原酸7.664 mg、迷迭香酸2.600 mg、丹酚酸B 6.444 mg，加50%甲醇制成每1 mL含丹参素44.010 μg、咖啡酸29.930 μg、绿原酸73.651 μg、迷迭香酸25.506 μg、丹酚酸B 62.249 μg的混合对照品溶液，作为加样回收母液。取已知成分含量的石见穿样品（编号SJC03）约0.5 g，平行3组，每组3份，精密称定，按样品中5种成分与对照品的质量比为0.5∶1、1∶1及1.5∶1的比例分别加入5种对照品，即0.5∶1组加入加样母液5 mL，再加50%甲醇至25 mL；1∶1组加入加样母液10 mL，再加50%甲醇至25 mL；1.5∶1组加入加样母液15 mL，再加50%甲醇至25 mL；将上述9 份供试品超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，滤过，取续滤液即得。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表4，丹参素加样回收率范围为93.21%～96.46%，RSD为1.25%；咖啡酸加样回收率范围为92.31%～95.63%，RSD 为1.71%；绿原酸加样回收率范围为93.37%～97.18%，RSD 为1.88%；迷迭香酸的加样回收率范围为92.97%～97.49%，RSD 为1.94%；丹酚酸B 的加样回收率范围为95.85%～101.22%，RSD 为2.01%。5 种酚酸类成分的回收率范围及RSD 值均符合规定，表明该分析方法准确度良好。

表4 准确度考察结果Table 4 Results of accuracy examination

2.2.4.7 耐用性试验 取石见穿药材粉末（编号SJC03）约1.0 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在不同色谱仪（Thermo Vanquish、Waters H-Class、Agilent 1290）、不同流速（0.38、0.40、0.42 mL/min）、不同柱温（38、40、42 ℃）条件下进行测定，计算各指标含量并计算RSD值，结果见表5。耐用性试验发现，本方法在不同色谱仪上均能良好重现，柱温与流速微小的变动后各指标的分离度均能保持良好，且在不同条件下5种酚酸类成分含量的RSD均小于5%，表明本方法耐用性良好。

表5 耐用性试验结果Table 5 Results of durability test w/(mg·g-1)

3 结果与分析

3.1 含量测定结果

根据上述方法测定20 批石见穿药材样品中水溶性浸出物及丹参素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、丹酚酸B 含量（为节约检测时间，5 种酚酸类成分测定所用对照品为混合对照品，具体为“2.2.4.2”中线性母液稀释10倍得到），结果见表6。其中水溶性浸出物的含量范围在16.500%～23.485%，丹参素的含量范围在0.398～1.278 mg/g，咖啡酸的含量范围在0.035～0.160 mg/g，绿原酸的含量范围在0.084～0.303 mg/g，迷迭香酸的含量范围在0.217～1.221 mg/g，丹酚酸B 的含量范围在0.247～2.042 mg/g。除了水溶性浸出物外，其余5 个指标成分批次间含量差异均较大。

表6 石见穿药材各指标含量测定结果Table 6 Results of content determination of various constituents w/(mg·g-1)

3.2 聚类热图分析[12]

将20批石见穿药材样品测定数据经标准化（采用Z-score 法）处理后，导入Hiplot 科研绘图平台，选择基于ward 模式下的“ward D2”法（含量从左到右一般呈现增加趋势），以“euclidean”为距离绘制聚类热图，结果如图2所示（图中颜色由深蓝到深红代表含量由低到高）。结果显示，20 批药材可分为5 类：其中SJC01、SJC02、SJC07、SJC09、SJC11 聚为一类，其中有2 批药材来自广东，3 批药材来自广西，该类样品各指标含量均较低；SJC03、SJC06、SJC15 聚为一类，当中有2批样品来自广东，1批样品来自山东，该类样品浸出物与丹酚酸B 两个指标含量较高；SJC05 与SJC14 聚为一类，样品分别来自广东与山东，该类样品大部分指标含量均较高；SJC04、SJC08、SJC16、SJC20 聚为一类，样品分别来自广东、广西、山东与湖北，该类样品咖啡酸含量均较高；余下SJC10、SJC12、SJC13、SJC17、SJC18、SJC19聚为一类，当中2 批样品来自广西，2 批来自安徽，1 批来自山东，1 批来自湖北，该类样品没有明显特征。总体而言，聚类与产地无明显相关性，同一产地的药材未能都聚为一类。

图2 20批石见穿药材的聚类热图分析Figure 2 Cluster heatmap analysis of 20 batches of Salvia chinensis

3.3 灰色关联度分析

目前中药分析所用的灰色关联度方法较多，主要有相对关联度与绝对关联度两种。相对关联度源于邓聚龙教授提出的“邓氏关联度”[11]，该方法虽有一定缺陷，但大量文献报道[13-17]均证实其具有一定实用性。而绝对关联度是改进的关联度计算方法之一，还有T 型关联度、斜率关联度、改进的绝对关联度、B型关联度、C型关联度等[11]，这些方法在中药质量分析领域中应用较少，无法验证其实用性，故本文不选择绝对关联度，而选用较为广泛应用的“相对关联度”。参考文献[13-14]中的方法，先按照公式Yik=Xik/Xk（Yik为规格化处理后的数据，Xik为第i个样品第k个指标的原始数据，Xk为i个样品第k个指标的平均值）对20批石见穿药材样品测定数据进行规格化处理，求得其最优及最差参考序列，结果见表7。再按公式（1）（2）计算各单元相对于最优、最差参考序列的关联系数，然后按公式（3）（4）计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联度，最后按公式（5）计算各评价单元的相对关联度，根据相对关联度大小对各评价单元进行排序，结果见表8。结果显示，排名前10 的样品中，有4 批来自山东，3批来自广东，2批来自广西，1批来自安徽，总体来看，山东产地的石见穿药材整体排名靠前，质量相对较好；而安徽与湖北产地的药材排名居中，安徽的排名稍高于湖北的；但广东与广西的药材既有排名靠前的也有排名靠后的，说明这两个产地的药材质量不稳定。

表7 20批石见穿样品的原始数据规格化处理结果Table 7 Results of raw data specifiation for 20 batches of Salvia chinensis

表8 20批石见穿样品关联度与相对关联度及排序Table 8 Correlation and relative correlation and ranking of 20 batches of Salvia chinensis

3.4 熵权TOPSIS分析

将20批石见穿药材含量测定数据导入SPSSPRO在线“专业统计服务的科学平台”[18]进行TOPSIS 分析，以熵权法为变量权重，得到各指标信息熵值及权重见表9，TOPSIS 评价法计算结果见表10。如表9所示，丹参素的熵值最小，对应权重最大，说明丹参素含量对石见穿药材的得分排序起重要作用；而咖啡酸熵值最大，对应权重最小，说明咖啡酸含量对样品的得分排序影响较小。如表10 所示，熵权TOPSIS 排序与灰色关联度分析结果较为相似，均显示山东省药材得分排名靠前且质量稳定，两种分析方法相互验证，为石见穿药材的质量评价提供较为客观的数据支持。

表9 石见穿含量测定各指标熵值及权重Table 9 Entropy value and weight of each index for content measurement of Salvia chinensis

表10 20批石见穿样品TOPSIS得分与排序Table 10 TOPSIS scores and ranking of 20 batches of Salvia chinensis

4 讨论

本研究建立了UPLC 法快速测定石见穿中5 种酚酸类成分，在方法摸索阶段对供试品进行全波长扫描（190～400 nm），并提取254、290、325 nm 3个不同吸收波长进行比较，发现在290 nm 下各色谱峰响应较好，基线平稳，故选择290 nm 作为检测波长。研究还比较了Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3 种不同品牌色谱柱对各色谱峰分离度的影响，最终确定以Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，5 个酚酸类指标均能达到基线分离。研究还比较了0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸3 种不同水相对图谱的影响，最终确定以0.1%甲酸为流动相，各色谱峰对称性较好。为确定最佳的供试品制备方法，研究比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇等5种不同提取溶剂，超声与回流两种提取方式，10 mL、25 mL、50 mL 3 种不同提取溶剂用量，最终确定以50%甲醇为提取溶剂，超声为提取方式，25 mL 为溶剂用量，石见穿药材中的5 个酚酸类成分均能得到充分提取。

为了更好的反映石见穿中的水溶性成分，本研究除了测定其5 种酚酸类成分含量，还增加水溶性浸出物的测定，以6 个指标含量共同评价来自5 个产地共20 批药材的质量。研究发现各批次样品除水溶性浸出物含量外，其余5 个指标含量差异均较大，最小值与最大值相差达到3 倍以上。聚类热图分析表明分类与产地无明显相关性，同一产地的药材未能都聚为一类。为了进一步评价不同产地药材的质量，本研究对20批药材含量测定数据进行了灰色关联度分析与熵权TOPSIS 分析。熵权TOPSIS 分析显示丹参素的权重最大，其次为绿原酸，说明这两个指标含量对石见穿药材的得分排序起重要作用，推测丹参素与绿原酸的批次间差异也是导致不同产地药材未能严格按产地进行聚类的原因。灰色关联度分析与熵权TOPSIS 分析结果较为相似，均表明山东产地的石见穿药材整体质量较优，而安徽与湖北产地的药材排名居中，安徽产地的质量稍优于湖北产地的，但广东与广西产地的药材质量不太稳定，排名呈两头分布。综合比较来看，山东所产的石见穿药材质量较佳。

石见穿为唇形科鼠尾草属药材，其酚酸类成分与同属植物丹参类似[4，19]。山东为丹参的主产区之一[20-21]，山东的大部分区域为温带季风气候，较少出现干旱或洪涝灾害，气候土壤均适宜丹参生长。研究表明山东产地的丹参药材水溶性成分比安徽与湖北的高[19]，推测山东的环境气候同样较适合石见穿生长。但中药材的质量受多种因素影响，除了产地外，药用部位、采收期与加工方式等均会对其质量造成不同程度影响。本研究组后续将进一步研究石见穿不同药用部位及不同采收期的药材质量，以期为石见穿药材的质量标准完善提供更充分的数据支持。