Cyr61的表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的研究

郑慧敏，李连兴

（赤峰市医院，内蒙古 赤峰 024000）

胃癌是全球常见的恶性肿瘤，中国胃癌发病例数占全球胃癌发病的42.6%、死亡例数占全球死亡的45%，位于全球发病率的第5位，死亡率的第6位[1]。目前，恶性肿瘤的靶向治疗被认为是未来恶性肿瘤治疗中最具前景的方向，然而靶向治疗的前提和关键是有合适的靶点[2]。因此，对胃癌细胞侵袭、转移和血管形成机制的研究可以为寻找到预防和治疗胃癌的靶点提供理论基础，对降低胃癌患者死亡率、延长患者寿命都具有十分重要的意义。

高半胱氨酸蛋白61(cysteine rich 61，Cyr61)是生长因子CCN家族中第一个被发现的成员。越来越多的证据表明肿瘤组织中Cyr61表现出不同程度的异常。一方面是过度表达，研究发现Cyr61在胃癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤中呈高表达[3,4]。有趣的是在非小细胞肺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌中Cyr61呈低表达状态[5,6]。因此，本研究继续探究Cyr61对胃癌细胞生物学行为的影响及分子机制，为Cyr61能否真正成为预防和治疗胃癌的新靶点提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂细胞MGC80-3细胞系获自中科院。RPMI-1640，DMEM培 养 液 购 自Corning公 司。RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司。蛋白Marker和ECL化学发光显色试剂盒购自Thermo公司。Transwell小室购自Corning公司，MTT检测试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司，pEGFP-H1/Cyr61病毒购于吉凯基因公司。针对蛋白质的抗体：Cyr61兔抗体（Abcam，美国，编号ab233097，按1:1000稀释）、GAPDH小鼠抗体（Santa cruz，美国，sc-32233，按1:2000稀释）。凋亡试剂盒购自eBioscience公 司。DPBS，Matrigel购自Corning公 司。Calcein-AM购自Thermo公司。

1.2构建表达沉默Cyr61的短发夹RNA（shorthairpin RNA,shRNA）的真核质粒表达载体pEGFP-H1/Cyr61设计RNAi沉默Cyr61表达在Cyr61 mRNA序列上的靶位点，选择3-5个靶位点；根据每个靶位点人工合成一对互补并编码短发夹状小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）的寡核苷酸链，将正、反义寡核苷酸链等比混合，退火形成DNA双链，保存在-20℃备用。同时合成阴性对照；将DNA双链克隆入能表达绿色荧光蛋白、抗性（新霉素）和人H1型RNA聚合酶Ⅲ启动子的真核质粒表达载体，经酶切鉴定正确后，命名为pEGFP-H1/Cyr61。

1.3细胞培养及转染使用RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清、100μg/mL链霉素和100IU/mL青霉素，并在37°C及5% CO2湿润的培养箱中培养细胞。为了构建Cyr61敲减的MGC80-3细胞系，利用阳离子脂质体转染pEGFP-H1/Cyr61重组质粒进入MGC80-3细胞中。

1.4蛋 白 印 迹 （Western blot） 收 集 转 染 后MGC80-3细胞，用PBS缓冲液洗涤两次，在预冷的2×Lysis Buffer裂解，将裂解后的细胞转移入EP管，将细胞在冰上裂解10-15min后，应用超声破碎细胞。离心细胞15分钟（4℃、12000g），吸取上清液，应用BCA法测蛋白浓度。将所有样本的蛋白浓度调整为2μg/μL，-80℃保存，备用。上样，浓缩胶80V，20min；分离胶120V，1h。电泳后，利用转移电泳装置电转2.5h（4℃、恒流300mA），再将蛋白转移到PVDF膜上。室温下用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）封闭1h。一抗孵育：加入封闭液将抗体稀释，然后在室温下与封闭好的PVDF膜孵育2h，用TBST缓冲液洗膜4次，每次8min。二抗孵育：将相应二抗用封闭液稀释，孵育1.5h（室温），用TBST缓冲液洗膜4次，每次8min。最后用X光显影。

1.5 MTT实验 将处于对数生长期的人胃癌细胞MGC80-3及转染pEGFP-H1/Cyr61细胞组胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；均匀铺板，细胞完全沉淀后，用显微镜观察各实验组及对照组的细胞密度；第二天培养终止前4h，在孔中加入20μL5mg/mL的MTT，无需更换溶液；4h后完全吸出培养液并加入100μL DMSO溶解甲基赞颗粒；振荡2~5min后酶标仪490/570nm检测OD值。

1.6细胞划痕实验 将处于对数生长期的对照组和转染pEGFP-H1/Cyr61细胞组，经胰蛋白酶消化后重新悬浮于细胞悬浮液中并计数；根据细胞大小确定铺板密度（50000cell/well），以第二日细胞数汇合度达到90%以上为准。37℃、5% CO2培养，培养体系为100μL/孔（每组3复孔）；第二天，用划痕测试仪对准96孔板的中心，轻轻向上推，形成划痕；使用PBS缓冲液轻轻漂洗2~3次，再加入含培养基（含1%FBS的血清）后扫板；37℃、5% CO2培养，选择合适的时间，根据愈合程度用Celigo扫板；最后用Celigo分析0h、8h、24h迁移面积。

1.7 Transwell实验 将Transwell小室放置在24孔板中，上室加入100μL无血清培养基，放入37℃培养箱中1h；制备无血清细胞悬浮液（105/孔）；移除上室中的培养基，并加入100μL细胞悬液，下室中加入600μL 30% FBS培养基；37℃，培养8h；将小室倒扣于吸水纸上，去除培养基，用棉拭子去除小室内的非转移细胞，放置小室在4%多聚甲醛固定液中0.5h；固定后取出小室，吸干小室表面的固定液，将1-2滴染色液滴到膜的下表面染色转移细胞1-3min，再将小室浸泡冲洗后晾干。每个transwell小室均随机选取视野进行显微镜拍照；应用200×的照片计数，统计分析并比较实验组与对照组细胞转移能力的差异：计算各组转移细胞数。

1.8血管生成实验 细胞感染后，铺2×105个细胞于6孔板中，待贴壁后用DPBS洗涤2次，更换无血清培养基培养24h后收集上清液。将Matrigel 4℃过夜融化，-20℃预冷实验用的孔板及枪头。Matrigel充分融化后，在预冷后的96孔板中每孔加入70μL Matrigel，凝固30min（37℃）备用。消化HMEC-1细胞，用无血清培养基洗2-3次，尽可能去除血清，加入预先收集的目的细胞培养上清液，将细胞重悬为3×104细胞/100μL，铺入96孔板。37℃培养2-4h后，弃去旧液，每孔加入50μL Calcein-AM浓 度 为0.2μM的 培 养 基37℃孵 育5～10min。荧光显微镜下观察，发现细胞已被染色后，置于CQ1仪中扫板，获得图片及数据。

2 结果

2.1 qPCR检测MGC-803细胞中Cyr61的表达量

结果显示，基因Cyr61在MGC-803细胞中的表达丰度为高。如图1。

图1 qPCR检测MGC-803细胞中Cyr61的表达量

2.2慢病毒感染人胃癌细胞MGC80-3

人胃癌细胞MGC80-3分别感染对照病毒NC和敲减Cyr61病毒KD，可明显观察到荧光。如图2。

图2 对照病毒NC和敲减Cyr61病毒KD感染后荧光图

2.3 qPCR检测Cyr61的表达量

MGC-803细胞中，相对于NC，KD1组Cyr61基因的敲减效率为27.1%；KD2组CYR61基因的敲减效率为45.8%。如图3。

图3 qPCR检测敲减Cyr61病毒后MGC-803细胞中Cyr61的表达量

2.4 Western blot检测Cyr61蛋白的表达量

Western blot实验检测敲减Cyr61病毒KD1和KD2组条带亮度显著低于对照组NC。感染后细胞组Cyr61蛋白被显著抑制。如图4。

图4 Western blot检测敲减Cyr61后MGC-803细胞中Cyr61的表达量

2.5敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3增殖能力的影响

应用MTT实验方法检测敲减Cyr61对人胃癌细胞增殖能力的影响。结果显示，相比对照组和敲减Cyr61组细胞的增殖能力无明显变化，如图5。

图5 敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3增殖能力的影响

2.6敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3迁移能力的影响

划痕实验检测敲减Cyr61基因后对人胃癌细胞迁移能力的影响。结果显示，对照组迁移率为34.17%，敲减Cyr61细胞组迁移率为40.16%。P＞0.05,无统计学意义，即敲减Cyr61后对胃癌细胞迁移能力无影响。如图6。

图6 敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3迁移能力的影响

Transwell实验检测敲减Cyr61对人胃癌细胞迁移能力影响。结果显示，对照组迁移细胞数为121个，敲减Cyr61细胞组迁移细胞数为109个。P＞0.05,无统计学意义，即沉默CYR61后对胃癌细胞迁移能力无影响。如图7。

图7 敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3迁移能力的影响

2.7敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3侵袭能力的影响

Transwell实验检测敲减Cyr61对人胃癌细胞侵袭能力影响。结果显示，对照组侵袭细胞数为121个，敲减Cyr61细胞组侵袭细胞数为109个。P＞0.05,无统计学意义，即沉默CYR61后对胃癌细胞侵袭能力无影响。如图8。

图8 敲减Cyr61对人胃癌细胞MGC80-3侵袭能力的影响

2.8敲减Cyr61对人胃癌细胞凋亡的影响

相比对照组NC，敲减Cyr61的KD组凋亡数无明显变化。P＜0.05，但是凋亡率小于5%，认为并没有发生明显的凋亡现象。如图9。

图9 敲减Cyr61对人胃癌细胞凋亡的影响

2.9敲减Cyr61对人胃癌细胞周期的影响

相比对照组NC，敲减Cyr61的KD组处于G1期的细胞经过T-Test分析显示P＜0.05，处于S期和G2/M期的细胞经过T-Test分析P＞0.05。如图10。

图10 敲减Cyr61对人胃癌细胞周期的影响

2.10敲减Cyr61对血管形成的影响

相对对照组NC，敲减Cyr61的KD组血管形成能力明显增加。如图11。

图11 敲减Cyr61对血管生成的影响

3 讨论

Cyr61是生长因子CCN家族中的成员。在包括胃癌在内的多种肿瘤中异常表达。已有研究表明，Cyr61促进胃癌，结肠癌[7]乳腺癌[8]等的进展。然而，也有报道称，Cyr61可抑制非小细胞肺癌、子宫内膜癌等的进展[5]。在关于胃癌的报道中发现，与非肿瘤胃黏膜样品相比，胃癌样品中Cyr61的表达显着上调。Cyr61的高表达与侵袭、淋巴结转移、远处转移、组织学分化差、TNM分期晚期和5年生存率降低有关[9]，而本研究的结果显示Cyr61不能促进胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，但也有实验研究表明，Cyr61在胃癌细胞增殖中起微不足道的作用[10]，这与本研究结果相符。还有多项研究表明Cyr61可以促进胃癌细胞的侵袭转移[11,12]，本研究结果未显示出类似结果。可能是受不同胃癌细胞系的影响，也可能因为本身Cyr61在不同肿瘤中的表达量及对不同肿瘤的生物学功能的影响都存在差异。因此，其对胃癌进展的影响还需进一步研究。

深入研究机制发现可能与肿瘤细胞类型中Cyr61引起不同通路的改变，以及肿瘤细胞对Cyr61诱导的凋亡及衰老是否敏感、或对血管生成因子是否限制相关[13]。Cyr61可通过与细胞外基质中的整合素以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，以及与细胞外基质中黏附的大量生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子直接结合，对正常生理和病理过程中的细胞黏附、增殖、移动、分化和新生血管形成起重要作用[14]。本研究通过检测Cyr61对胃癌细胞凋亡，细胞周期影响，也与其对胃癌生物学功能结果一致，均无影响。进一步探究对血管生成影响的结果显示，敲减Cyr61后血管形成能力明显增加。这似乎与现有报道不相符。其原因可能是Cyr61对肿瘤的影响受多种因素的控制，是不同通路相互作用的结果。所以，更多的功能及机制有待进一步研究。