设施根结线虫发病与未病土壤真菌多样性比较

秦立金，刘铭，李艳丽，刘凯炎，陈凡凡，祝海颖，陆鸣，庞文敏，张志洁，刘海婷

（1.赤峰学院 农学院；2.赤峰市农牧业综合检验检测中心；3.赤峰学院 化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

1 引言

番茄属于茄科番茄属，又名西红柿、番柿、洋柿子等，在国外有“金苹果”“爱情果”等美誉[1]。由于管理等问题，导致番茄根结线虫病害日益严重。根结线虫（Meloidogyne spp.）是一种在全世界发生和分布的植物内寄生线虫，寄主种类达到3000多种，严重威胁着世界农业的安全生产[2]在我国，根结线虫发生范围广，发病率高，防治困难，已成为严重阻碍我国农业生产的一大病害，每年因根结线虫造成经济损失巨大[3]。根结线虫病是危害番茄的主要土传病害之一，并且根结线虫的入侵会使植物根系形成根结，其他病害更容易侵染，严重影响番茄的品质。土壤中存在各种各样的微生物群体，它们对土壤有机质分解、养分循环、土壤结构、植物生长发育以及整个生态平衡都具有重要作用[4]。真菌是有机物质分解和土壤生物量的主要组成部分,在农业生态系统中起着重要的作用[5]。

有关土壤真菌多样性的研究已见报到，李天来[6]发现番茄连作后改变了土壤真菌种群平衡，这可能是导致番茄产生连作障碍的重要原因之一。王澎[7]等人发现施用有机氮(Gly)肥在一定程度上可以提高真菌的多样性，提高抗病原菌数量。以上研究在一定程度上都表明了发病与真菌多样性有关。

本试验拟测定设施番茄根结线虫发病与未发病土壤的真菌多样性指标，分析其在界、门、纲、目、科、属水平的多样性变化，找出发病与未发病土壤的真菌多样性差异，为以后根结线虫病的有效防控提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

设施番茄发病、未发病棚室土壤采自内蒙古赤峰市翁牛特旗杨营子设施番茄棚室。

2.2 实验设计

上茬番茄拉秧时，对设施番茄发病与未发病棚室进行土壤取样，每个棚室采集土壤3份；采样时间为上茬番茄拉秧时，同时，调查根结线虫发病率及病情指数；采集回的土样及时处理，过1mm筛，标记，-80摄氏度冰箱冷冻，待送检；对测得的ITS真菌多样性数据进行显著性检验和分析。

2.3 ITS测序实验流程

将田间采集的土壤样品利用OMEGA的试剂盒提取土壤DNA。对提取到的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测，查看基因组DNA的完整度与浓度。利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。ITS测序使用的文库构建步骤遵循Illumina测序仪文库构建方法。从基因组DNA样品开始，整个ITS测序具体步骤如下：本次测序以ITS2为目标区域进行引物设计，引物序列为fITS7GTGARTCATCGAATCTTTG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。使用DNA模板50ng，25uL的PCR体系，使用Phusion酶扩增25～35个循环。一轮PCR扩增反应之后，在正反向引物两端分别加上不同的barcodes，再进行下一轮扩增。扩增完成的PCR产物使用beads纯化之后进行上机测序。PCR产物用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer做归一化处理。构建好的文库上样到cBot或簇生成系统，利用Illumina MiSeq测序仪进行2x300bp paired-end测序。对于MiSeq测序获得的双端数据，首先根据barcode信息进行样品区分，然后根据overlap关系进行merge拼接成tag，接着对拼接完成的数据进行数据过滤，随后进行Q20、Q30等质控分析。对最终获得clean数据进行OTU聚类分析和物种分类学分析。

2.4 实验数据

采用IBM SPSS26.0对数据进行平均数±标准差计算和成对数据t检验。

3 结果和分析

3.1 界水平差异

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平绝对和相对丰度差异比较见表1和表2，发病土壤的Fungi/真菌界与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2未达到差异显著（P＞0.05），未发病老棚/CK1分别比发病/Ne和未发病新棚/CK2提高了9.62%和25.00%。

表1 根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平绝对丰度差异比较

表2 根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平相对对丰度差异比较

3.2 门水平差异比较

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平绝对和相对丰度差异比较见表3和表4，发病土壤的/NeAscomycota/子囊菌门和Unspecified_Fungi/未指明真菌与未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2未达到差异显著(P＞0.05)，Ascomycota/子囊菌门和Unspecified_Fungi/未指明真菌在未发病老棚/CK1相对丰度分别可达78.24%和3.56%（见表4），而在未发病新棚/CK2相对丰度分别为94.94%和3.35%。发病土壤/Ne的Basidiomycota/担子菌门与未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2未达到差异显著(P＞0.05)，但未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2达到差异显著(P＜0.05)，相对丰度为18.19%和2.16%，未发病老棚土壤/CK1是未发病新棚土壤/CK2的9.69倍。

表3 根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平绝对含量差异比较

表4 根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平相对含量差异

3.3 纲水平差异比较

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌纲水平绝对和相对丰度差异比较见表5和表6，发病土 壤/Ne的Leotiomycetes/锤 舌 菌 纲 和Agaricomycetes/伞菌纲与未发病老棚土壤/CK1和未发病新棚土壤/CK2未达到0.05差异显著（p＞0.05），但未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2差异显著（p＜0.05），未发病老棚土壤/CK1分别是未发病新棚土壤/CK2的5.32倍和10.04倍（见表5），其中，Leotiomycetes/锤舌菌纲和Agaricomycetes/伞菌纲在未发病老棚土壤/CK1相对丰度可达35.57%和18.05%，而在未发病新棚土壤/CK2的相对丰度分别为8.40%和2.06%（见表6）；发病土壤的Dothideomycetes/座囊菌纲与未发病老棚土壤/CK1未达到差异显著（p＞0.05），但与未发病新棚土壤/CK2差异显著，（p＜0.05），是未发病新棚土壤/CK2的17.84倍（见表5），其中，在发病土壤/Ne和未发病新棚土壤/CK2的相对丰度分别为3.62%和3.35%（见表6）；发病土壤的Lecanoromycetes/茶渍纲、Sord ariomycetes/子囊菌纲和Unspecified_Fungi（未指明）与未发病土壤未达到差异显著（p＞0.05）（见表5），其中，Unspecified_Fungi/未指明绝对和相对丰度占据较大比例，在3种土壤中，相对丰度分别可达74.09%、44.22%和89.41%。

表5 根结线虫发病与未发病土壤真菌纲水平绝对丰度差异比较

表6 根结线虫发病与未发病土壤真菌纲水平相对丰度差异比较

3.4 目水平差异比较

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌目水平绝对和相对丰度差异见表7和表8，发病土壤/Ne的Agaricales/伞 菌 目、Cantharellales/鸡 油 菌 目、Helotiales/柔 膜 菌 目、Rhytismatales/斑 痣 盘 菌 目、Hypocreales/肉 座 菌 目、Ostropales/厚 顶 盘 目、Hymenochaetales/锈革孔菌目、Sebacinales/蜡壳耳目和Unspecified_Fungi/未指明真菌与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚/CK2均未达到差异显著(P＞0.05)。发病土壤Pleosporales/腔菌目与未发病老棚土壤/CK1未达到差异显著(P＞0.05)，但与未发病新棚土壤/CK2达到差异显著（P＜0.05），是未发病新棚土壤/CK2的17.84倍，相对丰度分别为1.84%和0.12%。

表7 根结线虫发病与未发病土壤真菌目水平绝对丰度差异比较

表8 根结线虫发病与未发病土壤真菌目水平相对丰度差异比较

3.5 科水平差异比较

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌科水平绝对和相对丰度差异比较见表9和表10，发病土壤/Ne的Marasmiaceae/小皮伞科、Ceratobasidiaceae/角 担 菌 科、Agaricaceae/伞 菌 科、Rhytismataceae/斑 痣 盘 菌 科、Hypocreaceae/肉 座 菌 科、Stictidaceae/肉 星 裂 菌 科、Helotiaceae/柔 膜 菌 科、Hymenochaetaceae/刺革菌科、Sebacinaceae/蜡壳耳科、Pleosporaceae/孢 菌 科、Amanitaceae/鹅 膏 科 和Unspecified_Fungi/未分类真菌与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2均未达到0.05差异显著(P＞0.05)。发病土壤/Ne的Psathyrellaceae/水蕨科与未发病新棚土壤/CK2达到差异显著（P＜0.05），是未发病新棚土壤/CK2的9.13倍，相对丰度分别为1.12%和0.02%。发病土壤/Ne的Inocybaceae/丝盖伞科与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2均未达到0.05差异显著(P＞0.05)，但未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚/CK2差异显著（P＜0.05），未发病老棚土壤/CK1是未发病新棚/CK2的4.81倍，在未发病老棚/CK1与未发病新棚/CK2的相对丰度分别可达0.04%和0.01%。

表9 根结线虫发病与未发病土壤真菌科水平绝对丰度差异比较

表10 根结线虫发病与未发病土壤真菌科水平相对丰度差异比较

3.6 属水平差异比较

设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌属水平绝对和相对丰度差异见表11和表12，发病土壤/Ne的Agaricus/伞 草 属、Lophodermium/散 斑 壳属、Trichoderma/木 霉 属、Hymenochaete/刺 革 菌 属、Sebacina/蜡壳菌属和Unspecified_Fungi/未分类真菌与未发病老棚土壤/CK1和未发病新棚土壤/CK2均未达到0.05差异显著(P＞0.05)。未发病土壤/Ne的Coprinellus/鬼伞属与未发病老棚土壤/CK1未达到0.05差异显著(P＞0.05)，与未发病新棚土壤/CK2达到显著差异(P＜0.05)，是未发病新棚土壤/CK2的9.13倍，相对丰度分别为0.12%和0.02%。发病土壤/Ne的Inocybe/丝盖伞属与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2均未达到0.05差异显著(P＞0.05)，但未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚/CK2差异显著（P＜0.05），未发病老棚土壤/CK1是未发病新棚/CK2的4.81倍，在未发病老棚/CK1与未发病新棚/CK2的相对丰度分别可达0.03%和0.01%。

表11 根结线虫发病与未发病土壤真菌属水平绝对丰度差异比较

表12 根结线虫发病与未发病土壤真菌属水平相对丰度差异比较

4 讨论与结论

根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种高度专化型的植物病原线虫，主要危害植物的根部，造成植株产量降低，甚至死亡。南方根结线虫(M.incognita)寄主范围广，在国内分布最广，危害最大，可加重土传性真菌危害和大部分细菌病害的发生，严重威胁全世界西甜瓜、蔬菜、粮食作物等作物的生长[10-14]，使我国各种作物年平均产量损失达10-15%[15]。

张仁军[8]等人分析了烟田根际根结线虫病土与周边健康土壤微生物群落，通过对比分析发现健康烟田与根结线虫发病烟田根际土壤真菌微生物群落在门和属水平上组成相似，但物种丰度存在差异，其中，担子菌门(Basidiomycota)在健康烟田中占优势，子囊菌门(Ascomycoda)。在发病烟田中占优势。本实验结果表明，Ascomycota/子囊菌门在根结线虫发病与健康土壤中差异不显著，本研究结果与前人[8]研究结果存在不一样的地方，分析原因可能是因为取土地点和发病作物不同导致的，本实验取土的地点为内蒙古赤峰市设施番茄棚室土样，而张仁军等人取土土样为云南省烟草根际土壤。

本研究结果表明，发病土壤的Basidiomycota/担子菌门与未发病老棚和未发病新棚未达到差异显著，但未发病老棚和未发病新棚达到差异显著，且未发病老棚是未发病新棚的9.69倍，Basidiomycota/担子菌门为未发病土壤的优势菌群，此结果与前人[8]一致。陈波[9]等人对香蕉枯萎病区土壤真菌多样性进行了分析，发病同一地区蕉园中的发病蕉园土壤真菌群落多样性比健康土壤丰富，但未进行界、门、纲、目、科、属水平的具体分析。

本研究结果表明，设施番茄根结线虫发病与未发病土壤，未发病老棚和新棚土壤的真菌群落多样性不同，未发病老棚Ascomycota/子囊菌门、Leo-tiomycetes/锤舌菌纲、Agaricomycetes/伞菌纲、Inocybaceae/丝盖伞科、Inocybe/丝盖伞属显著高于未发病新棚，发病土壤与未发病老棚的Pleosporales/腔菌目显著高于未发病新棚，发病土壤Psathyrellaceae/水蕨科、Coprinellus/鬼伞属显著高于未发病新棚。综上所述，内蒙古赤峰地区设施番茄根结线虫发病土壤和未发病老棚土壤的真菌多样性高于未发病新棚土壤。