血凝与血凝抑制试验

高 波

（瓦房店市动物疫病预防控制中心，辽宁 瓦房店 116300）

HA是血凝试验，HI是血凝抑制试验。HI试验广泛应用于各大养殖禽基地检测禽流感病毒各亚型抗体。做好此试验对提高养殖业生产、增加经济效益有决定性的作用。2022年7月20日，接到盲样比对任务，共6份样品，试验具体操作步骤如下。

1 PPS的制作

PPS磷酸盐缓冲剂一袋加入两升的纯化水，之后制好待用，pH7.2。

2 红细胞的配制

采集单位内4只无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液与等体积阿氏液混合均匀，用pH7.2，0.01摩尔/升的PPS洗涤，每次用2000转离心5分钟，取出后用吸管吸出上清液弃去，再加入工作用PPS，这样洗涤3次，最后一次吸出上清液后要把红细胞表面的少量白细胞吸出弃掉。洗涤后用一毫升的红细胞配99毫升的PPS配制成工作用的红细胞悬液，4℃保存备用。

3 血凝HA试验操作方法

在90℃微量反应板中，每孔加入0.025毫升PPS。

第一孔加入0.025毫升抗原依次做0.025毫升的对被稀释至第11孔。

每孔加入0.025毫升PPS。

每孔加入0.025毫升红细胞悬液。

将反应板在振荡器上振荡1～2分钟，混合反应物在室温23℃静置30分钟后，观察结果。

将反应板倾斜60°观察红细胞流淌状态，完全无眼泪样流淌的最高稀释倍数为血凝效价。最终测得抗原效价为1∶512。

4 HI试验

根据已经测出的HA效价1∶512来配制4单位抗原。512除以4即是4单位抗原的稀释倍数1∶128。

1.反应板中1～8排的1～11孔加入配制好的0.025毫升PPS，12孔加入0.05毫升PPS。

2.在一次性90°微型微量反应板第一孔加入0.025毫升待检血清，用排枪充分吹打后吸0.025毫升于第二孔依次对倍稀释至第10孔，再从第10孔吸取0.025毫升弃去。

3.在第7排的第1孔加入阴性血清倍比稀释至第4列。

4.在第8排的第1孔加入阳性血清倍比稀释至第10列。

5.反应板的1～11孔全部加入0.025毫升的4单位工作抗原，23℃静置30分钟。

6.反应板的各孔加入0.025毫升已经配制好的鸡红细胞悬液，轻轻混匀加入后静置40分钟，40分钟后判定结果。最终测得6份样品，效价见表1。

表1 H5亚型病毒抗体检测结果

5 注意事项

第一，要严格控制试验条件。红细胞配制的浓度和抗原配制的浓度直接影响结果，还要严格把控试验温度和试验的作用时间。

第二，用pH7.2的PPS作为稀释液。

第三，试剂有沉淀或污染，不能使用。

第四，配制的4单位抗原配好后应在2小时内用完。

第五，抗原开封溶解后放置在-15℃冷冻保存。

第六，从冰箱里取出恢复至室温后使用两小时左右。一周后，上级部门反馈结果完全正确。

综上所述，要想做好此试验，必须按照操作规程，牢记注意事项，一定能成功。