NOL8对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

王笑笑，陈 曦，李敏敏，宋 宁，孙冬瑗，蒋英英,

1.潍坊医学院口腔医学院，山东 潍坊 261053；2.潍坊医学院附属医院口腔科，山东 潍坊 261035

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部常见的鳞状细胞癌，其病因包括吸烟、饮酒及人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染等［1-2］。对于早期OSCC患者，手术和放疗是肿瘤根治的两种主要方法［3］。而对于晚期患者，由于OSCC复发率高，5年生存率仅58%［4-5］。因此，了解OSCC的分子特征，寻找有希望的治疗靶点，对早期发现OSCC、改善患者预后具有重要意义。

核仁蛋白8（nucleolar protein 8，NOL8）是一种基因编码蛋白质，与胃癌、结直肠癌、前列腺癌的发生密切相关［6-8］。作为RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP)，可能参与肿瘤细胞转录后水平的基因表达调控和核糖体的生物发生［9-11］。然而NOL8在OSCC中的作用及其机制目前仍不清楚。

本研究主要探究NOL8在OSCC细胞中的表达情况，观察NOL8表达水平变化后对OSCC细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影响，旨在为OSCC机制的研究和诊断治疗提供新的线索。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和主要试剂

OSCC细胞系HN6和CAL-27由上海交通大学医学院附属第九人民医院赠予，正常对照细胞由口腔黏膜上皮细胞原代培养。HN6和CAL-27培养于DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清、2%青霉素-链霉素，细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%、相对饱和湿度的培养箱中培养。DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液均购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，0.25%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶溶液购自苏州新赛美生物科技有限公司，TRIzol试剂购自武汉艾瑞科生物科技有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，Lipo8000TM转染试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，脱脂奶粉购自广州赛国生物科技有限公司，matrigel基质胶购自美国Corning公司，细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本株式会社同仁化学研究所，二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、NOL8均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）、含有吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（tris-buffered saline with Tween-20，TBST）均购自北京索莱宝科技有限公司，Ki-67、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）及β-actin抗体均购自英国Abcam公司，波形蛋白（vimentin）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1 数据库在线分析

应用基因表达谱交互分析2（gene expression profiling interactive analysis 2，GEPIA2）（gepia2.cancer-pku.cn）［12］、肿瘤免疫评估资源（tumor immune estimation resource，TIMER）（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］、阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，UALCAN）（http://ualcan.path.uab.edu）［14］及RNA相互作用数据库（the encyclopedia of RNA interactomes，ENCORI）（http://starbase.sysu.edu.cn）［15］在线分析NOL8在头颈部鳞癌组织中的表达情况。GEPIA2数据库使用“Expression DIY”下的“Box plot”进行检索，设置条件为：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC。TIMER数据库使用“Diff Exp”进行检索，设置条件为：①Gene Symbol：NOL8；② Cancer：HNSC。UALCAN数据库使用“TCGA”进行检索，设置条件为：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC；③Analysis：Expression。ENCORI数据库使用“Pan-Cancer”下的“Gene Differential Expression”进行检索，设置条件为：①Gene：NOL8；② Cancer：HNSC；③Chart type：Box plot；④ Data scale：log2-scale。

1.2.2 RNA提取、反转录及RTFQ-PCR实验

用TRIzol法提取细胞的总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录。使用RTFQ-PCR试剂盒进行目的基因扩增，反应条件为：预变性（循环数1次）：95 ℃ 30 s；PCR（循环数40次）：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s。NOL8引物正向序列为5‘-GTCAGCCCTCAGTCATGGATT-3‘，反向序列为5‘-CACACGAAGGCAGTTTTTCATC-3‘；β-actin正向序列为5‘-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3‘，反向序列为5‘-CTCCTTAATGT CACGCACGAT-3‘。

1.2.3 细胞转染实验

由广州锐博生物科技有限公司设计合成NOL8小干扰RNA，分别为实验组（si-NOL8-1，si-NOL8-2）和阴性对照组，si-NOL8-1靶序列为5‘-GCAACAGGCTGCACAAAAA-3‘，si-NOL8-2靶序列为5‘-GGAGTGGATTTCCATATGA-3‘。将细胞放于6孔板中，细胞密度为60%～ 80%，24 h后应用Lipo8000TM试剂配制转染体系，混合后静置20 min，轻滴入6孔板中，放于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h后，采用RTFQPCR进行敲低效率检测，并进行后续实验。

由汉尹生物科技（上海）有限公司设计合成NOL8慢病毒过表达载体，分为实验组（NOL8）和阴性对照组。将细胞放于6孔板中，细胞密度为20%～ 30%，24 h后每孔加入10 mg/mL聚凝胺进行NOL8过表达慢病毒转染。于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养72 h后更换含10 μg/ mL嘌呤霉素的培养基，筛选2～ 3次建立NOL8过表达慢病毒稳定表达的细胞株。

1.2.4 CCK-8实验

将转染的细胞计数后以1×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中，每组3个复孔，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中，每天定时加入CCK-8试剂，再置于培养箱中培养2 h后，使用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度（D）值，连续检测5 d。

1.2.5 划痕愈合实验

将细胞接种于6孔板中，转染后待细胞密度达到100%后，行划痕操作，1×PBS冲洗后，在显微镜下于0、24及48 h观察记录划痕愈合情况。

1.2.6 Transwell实验

将matrigel基质胶均匀铺于transwell上室中，用于细胞侵袭实验。细胞转染后，用无血清DMEM高糖培养基重悬并计数，在transwell上室内接种5×104个细胞/200 μL，下室内加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，放入37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24～ 48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，0.5%结晶紫染色，擦去未侵袭的细胞，随机选取5个视野在显微镜下观察拍照。

1.2.7 蛋白质印迹法（Western blot）实验

细胞转染48 h后，PBS冲洗细胞3次，加入全细胞裂解液裂解细胞，收集裂解液后于105℃金属浴中煮10 min，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，根据蛋白浓度加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液。然后进行配胶，上样，10%SDS-PAGE转膜。5%脱脂奶粉封闭后，一抗［E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）］4 ℃温育过夜。第2天二抗室温温育1 h，最后用电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）超敏发光液在凝胶成像系统上显影，成像后用Image J软件进行灰度值分析。

1.2.8 裸鼠皮下移植瘤模型

选用BALB/c 4周龄裸鼠构建皮下移植瘤模型。分别收集NOL8过表达及对照组CAL-27细胞2×107个/mL，于裸鼠下肢两侧背部皮下注射100 μL细胞悬液，每3～ 5 d观察移植瘤的生长。3周后结束观察并将裸鼠安乐死，取肿瘤组织拍照并称重。此外，将瘤体于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、石蜡包埋、切片后进行H-E染色，并使用Ki-67抗体进行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色，在显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0软件对所有数据进行统计，计量资料均以表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOL8在OSCC组织及细胞系中的表达情况

TIMER、GEPIA2、ENCORI及UALCAN数据库在线分析显示，在头颈部鳞癌中，与癌旁正常组织相比，NOL8在头颈部鳞癌组织中的表达明显上调（图1A～ 1D）。RTFQ-PCR实验检测NOL8在3种细胞系中的表达情况，与正常口腔黏膜细胞相比，NOL8在OSCC细胞系HN6、CAL-27中的表达水平较高（图1E）。

图1 NOL8在OSCC组织及细胞系的表达情况Fig.1 The relative expression of NOL8 in OSCC tissues and cell lines

2.2 敲低NOL8表达对OSCC细胞增殖能力的影 响

RTFQ-PCR实验结果显示，si-NOL8-1、si-NOL8-2的相对表达量明显低于阴性对照组（图2A）。CCK-8实验检测结果显示，转染NOL8小干扰RNA后CAL-27细胞增殖能力显著降低（图2B）。

图2 敲低NOL8表达对OSCC细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect of knocking down NOL8 expression on the cell proliferation of OSCC

2.3 敲低NOL8表达对OSCC细胞迁移及侵袭能力的影响

划痕愈合实验结果显示，48 h时si-NOL8-1、si-NOL8-2与阴性对照组细胞相比，敲低NOL8的表达可限制CAL-27细胞迁移能力（图3A）。Transwell实验结果显示，敲低NOL8表达后，CAL-27细胞的体外侵袭能力同样被抑制（图3B）。

图3 敲低NOL8表达对OSCC细胞的迁移及侵袭能力的影响Fig.3 Effect of knocking down NOL8 expression on cell migration and invasion of OSCC

2.4 过表达NOL8对OSCC细胞增殖能力的影响

RTFQ-PCR实验结果显示，在CAL-27和HN6细胞中，NOL8过表达组（NOL8）的相对表达量明显高于阴性对照组（图4A）；CCK-8实验检测结果显示，过表达NOL8组的CAL-27和HN6细胞增殖能力显著高于阴性对照组（图4B）。

图4 过表达NOL8对OSCC细胞增殖能力的影响Fig.4 Effect of overexpression of NOL8 on cell proliferation of OSCC

2.5 过表达NOL8对OSCC细胞迁移及侵袭能力的影响

划痕愈合实验结果显示，24 h时CAL-27及HN6细胞中NOL8过表达组的愈合率均高于阴性对照组（图5A）。Transwell实验结果显示，在过表达NOL8后，CAL-27及HN6细胞的体外侵袭能力增强（图5B）。

图5 过表达NOL8对OSCC细胞迁移及侵袭能力的影响Fig.5 Effect of overexpression of NOL8 on cell migration and invasion of OSCC

2.6 NOL8表达改变对OSCC细胞EMT的影响

Western blot实验结果显示，在CAL-27细胞中敲低NOL8表达后，E-cadherin蛋白的表达水平升高，而N-cadherin和vimentin蛋白的表达水平降低；在CAL-27及HN6细胞中过表达NOL8后，E-cadherin蛋白的表达水平降低，而N-cadherin和vimentin蛋白的表达水平升高（图6）。

图6 NOL8表达改变对CAL-27和HN6细胞EMT相关蛋白的影响Fig.6 Effect of the change of NOL8 expression on EMT-related proteins in CAL-27 and HN6 cells

2.7 NOL8表达改变对裸鼠皮下移植瘤生长的影 响

裸鼠皮下移植瘤模型实验结果显示，NOL8过表达的CAL-27细胞形成的皮下移植瘤瘤体体积（图7A）及瘤重（图7B）均显著大于阴性对照组。通过瘤体组织H-E和Ki-67免疫染色进一步观察瘤体组织学形态，发现NOL8过表达CAL-27细胞的移植瘤生长较阴性对照组更迅速（图7C）。

图7 NOL8表达改变对裸鼠皮下移植瘤生长的影响Fig.7 Effect of NOL8 expression on the growth of subcutaneously xenograft tumor in nude mice

3 讨论

OSCC是世界范围内常见的人类恶性肿瘤，目前采用的手术、放疗、生物免疫等联合治疗取得了显著进展，但由于肿瘤复发率高，患者5年生存率低，寻找新的OSCC预后预测标志物和治疗靶点对改善患者的诊断、治疗和预后至关重要［3，16］。

NOL8含有RNA识别基序，是一种RBP，能够在转录后水平调控基因表达，包括对mRNA前体的剪接和加工、mRNA的稳定性及其降解等过程［9，17］。既往研究表明，NOL8与多种类型癌症的生物学行为密切相关，如前列腺癌、胃癌和结直肠癌［6-8］。在前列腺癌中，NOL8高表达与前列腺癌低生存率相关，并且可以通过激活β-catenin/TCF信号通路促进EMT，进而促进前列腺癌细胞迁移和侵袭［6］。此外，NOL8与结直肠癌的临床预后也有关［7，18］。NOL8不仅通过促进细胞迁移和侵袭发挥促癌作用，还可以通过促进细胞凋亡从而发挥在弥漫性胃癌中的抑癌作用［8］。本研究通过数据库分析发现，NOL8在OSCC组织及细胞系中表达显著上调，表明其可能与肿瘤的发生、发展进程具有密切联系。通过体内外功能实验发现，NOL8高表达可以显著提高OSCC细胞增殖、迁移及侵袭能力。

OSCC转移率高，其转移往往与肿瘤迁移和侵袭有关，进一步探究OSCC转移的相关机制至关重要［16］。研究［19-20］发现，EMT在OSCC侵袭和转移中发挥关键作用，能够诱导恶性肿瘤细胞侵袭，EMT过程的癌细胞的外形及内部分子都发生了变化，其中上皮性标志物（E-cadherin）表达减少和间质标志物（N-cadherin、vimentin）表达增加能够促进肿瘤的侵袭及转移。有研究［19］发现，Wnt/β-catenin和Notch通路等可以通过诱导EMT来促进癌症转移。此外，NOL8可以调控转录后水平的基因表达，如对mRNA前体hnRNA的剪接加工和mRNA的稳定性及其降解等过程［17］。进一步研究显示，敲低NOL8可以上调E-cadherin的表达水平和下调N-cadherin、vimentin的表达水平，而过表达NOL8则结果相反，表明NOL8可促进OSCC细胞EMT的发生。初步判断NOL8可以通过诱导EMT发生进而影响OSCC细胞迁移及侵袭能力，但其参与和调控这一过程的具体机制有待进一步研究。

综上所述，NOL8在OSCC组织及细胞中表达上调，并可以促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭，NOL8还能够诱导OSCC细胞EMT的发生。本研究证实，NOL8作为OSCC的致癌因子，可能为OSCC的发生、发展机制研究提供新的思路，为OSCC的防治提供新的线索。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。