自主感光视网膜神经节细胞与彩色光瞳孔测量

沈士雅 竺慧 李蕊 李萧萧 刘虎

自主感光视网膜神经节细胞（Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells,ipRGCs）是视网膜神经节细胞的一个亚类，含有光敏蛋白——黑视蛋白（Melanopsin），故具有自主感光的特性，又称为含黑视蛋白的视网膜神经节细胞（Melanopsin-containing retinal ganglion cells,mRGCs）。ipRGCs位于视网膜内层，胞体大、树突长而分支稀疏，互相重叠、围绕黄斑中心凹在视网膜上形成大的网状结构[1]。除经典光感受器（视杆和视锥细胞）外，ipRGCs构成视网膜上第三类光感受器。ipRGCs通过将轴突直接投射到橄榄顶盖前核（Olivary pretectal nucleus,OPN）以介导瞳孔对光反应（Pupillary light reflex,PLR）[2]；同时也投射至下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）、膝状体间小叶（Intergeniculate leaflet,IGL）等脑区，以调控昼夜节律、睡眠等功能[3-4]。

笔者主要对ipRGCs介导PLR的通路、视杆/视锥细胞和黑视蛋白引起的PLR特点、彩色光瞳孔测量方法及其在眼科疾病中的应用进行介绍总结，希冀为临床上疾病的诊断和鉴别诊断提供新思路。

1 PLR主要由ipRGCs介导产生

最初在20世纪，Keeler[5]发现有严重外层视网膜变性、缺乏多数视锥和视杆细胞的小鼠仍有PLR。之后Freedman等[6]和Lucas等[7]发现完全没有视锥、视杆细胞的小鼠也仍有PLR。到21世纪，黑视蛋白及表达黑视蛋白的视网膜神经节细胞被发现，人们开始不断探索这类新细胞的潜在功能。研究发现，黑视蛋白基因敲除（但仍有ipRGCs细胞）小鼠的PLR出现减弱，但仍存在[8]；对缺乏视锥、视杆细胞的小鼠行黑视蛋白基因敲除，则PLR完全消失[9]；缺乏ipRGCs细胞的小鼠，其PLR将明显减弱[10]。以上结果提示由视网膜到OPN的光信号主要是由ipRGCs介导传递，小部分可能由传统的视网膜神经节细胞介导（见图1）。

Belenky等[11]在小鼠中通过电子显微镜观察到无长突细胞和双极细胞的突触在内丛状层中与ipRGCs的树突相联系，而无长突细胞和双极细胞接受视杆和视锥细胞的信号输入，证明ipRGCs可被来自视杆、视锥细胞的信号激活从而产生PLR。此外，ipRGCs所含的黑视蛋白也可直接感受光信号，产生PLR。

2 视杆/视锥细胞和黑视蛋白产生的PLR存在差异

首先，黑视蛋白对波长约480 nm的短波长蓝光最为敏感，而视杆细胞的敏感波长约505 nm，长波长敏感视锥细胞（L cone）约567 nm，中波长敏感视锥细胞（M cone）约541 nm，短波长敏感视锥细胞（S cone）约445 nm[12]。其次，黑视蛋白对光的敏感程度不如视杆/视锥细胞。视杆细胞对低强度光敏感（6～7 log quanta·cm-2·s-1），视锥细胞对中等强度光敏感（10～11 log quanta·cm-2·s-1），而黑视蛋白对高强度（11～12 log quanta·cm-2·s-1）、连续的光敏感[2]。此外，黑视蛋白介导的PLR更为缓慢和持久。PLR包括瞬变收缩（Phasic response）和强直收缩（Tonic response）2个成分。瞬变收缩是指闪光刺激时或光照开始时发生的瞬时、大幅度的瞳孔收缩反应，主要由视锥和视杆细胞介导；强直收缩是指连续暴露于光照时发生的持续瞳孔收缩反应，在低至中等强度光照下主要由视杆细胞介导，在高强度光照下主要由黑视蛋白介导，目前视锥细胞对强直收缩的作用尚不明确[13-14]。光照停止后瞳孔由收缩状态逐渐扩大的过程也存在瞬变和强直2个成分[15-16]。当暴露于红光或低至中等强度的光照时，光照停止后瞳孔会快速恢复至原大小；当暴露于蓝光或高强度的光照时，光照停止后瞳孔则缓慢恢复[17-18]。在盲人和视网膜外层功能缺陷的小鼠中，光照后的瞳孔快速恢复反应会缺失或明显受损[15,19]。以上结果提示，光照停止后瞳孔的快速恢复反应受视杆/视锥细胞影响，而光照停止后瞳孔缓慢恢复反应主要由黑视蛋白引起，这种缓慢反应也被称为光照后瞳孔反应（Postillumination pupillary response，PIPR）。

图1.自主感光视网膜神经节细胞在瞳孔对光反射的传入通路中发挥作用Figure 1.IpRGCs play a role in the afferent pathway of PLRIpRGCs,intrinsically photosensitive retinal ganglion cells;PLR,pupillary light reflex;OPN,olivary pretectal nucleus;E-W nucleus,Edinger-Westphal nucleus.

3 彩色光瞳孔测量法可评估视杆细胞、视锥细胞和含黑视蛋白的ipRGCs的功能

由于视杆细胞、视锥细胞和黑视蛋白产生的PLR各具特点，因此可利用不同光信号选择性地刺激视杆细胞、视锥细胞和黑视蛋白以产生不同的PLR。视杆细胞对低强度光敏感，具有最低的激活阈值，敏感波长接近蓝光，因此可在产生暗视觉的环境内（亮度小于0.001 cd/m2）使用低强度的蓝光检测视杆细胞产生的PLR以评估视杆细胞功能；视锥细胞对光的敏感性低于视杆细胞，且主要对长波长的光敏感，因此在产生明视觉的环境内（亮度大于3 cd/m2）使用红光检测视锥细胞产生的PLR以评估视锥细胞功能；黑视蛋白对光反应的激活阈值最高，且对短波长蓝光敏感，因此可使用高强度蓝光检测黑视蛋白产生的PLR以评估含黑视蛋白的ipRGCs功能。以上即彩色光瞳孔测量法[也被称为选择性波长瞳孔测量法(Selective wavelength pupillometry）]的基本原理。其大概过程为：使用照明系统产生特定波长、强度、时长的光照，交替刺激瞳孔诱发PLR，同时使用红外瞳孔测量仪实时采集瞳孔形态、记录瞳孔直径变化；以时间为横轴、以瞳孔直径为纵轴绘制曲线，利用该曲线来反映光照开始和停止后的瞳孔反应，评估每种类型光感受器的功能。目前使用的光刺激方案大致分为两类：一类使用短时长光照（包括1 s、10 s和20 s等），另一类使用连续光照（大于30 s，光照强度呈阶梯样递增或坡样递增）。有研究表明，光刺激前先进行暗适应有利于检测视杆细胞介导的PLR，而在蓝光背景下行红光刺激有利于检测视锥细胞相关的PLR，因为蓝光背景可抑制黑视蛋白和视杆细胞活性[20]。

含黑视蛋白的ipRGCs功能主要通过光照停止后产生的PIPR进行评估。检测PIPR时，最理想的光应为靠近黑视蛋白最敏感波长（约480 nm）的蓝光，但只要光线强度足够，任何波长的光均能产生PIPR[21]。有研究采用持续时间4 ms～30 s内的光刺激诱发PIPR，结果发现持续时间为1 s的光刺激可产生明显的、稳定的、持续时间长的PIPR，因此具有较高实用性[22]。在众多用于定量测量PIPR的指标中，PIPR幅度（光照停止后特定时间点瞳孔缩小的程度，常用光照停止后第6秒）和平台期PIPR（PIPR曲线达平台期时瞳孔缩小的程度）变异性最小、可靠性最高[22]。

4 彩色光瞳孔测量在眼科疾病中的应用现状

目前已有多项研究采用彩色光瞳孔测量法分析不同眼科疾病的视网膜光感受器功能改变，这些眼科疾病包括青光眼[23-29]、糖尿病视网膜病变[30]、年龄相关性黄斑变性[31]、缺血性视神经病变[32]和遗传性线粒体视神经病变[33-35]等。

尽管采用的彩色光瞳孔测量方案不同，但既往研究均显示PLR，尤其是PIPR，在青光眼患者中存在改变。Kankipati等[23]用10 s的红光（623 nm）及蓝光（470 nm）分别刺激散瞳后的一只眼，记录对侧眼的瞳孔直径变化，发现与健康对照相比，青光眼患者中PIPR显著降低；青光眼视神经病变程度越重，PIPR越弱。Adhikari等[24]对早期青光眼患者进行左眼散瞳处理，使用1 s的蓝光（464 nm）和红光（658 nm）交替刺激视网膜的部分象限，记录右眼的瞳孔直径变化，发现在早期青光眼患者中已经出现了PIPR的改变。Najjar等[25]让受试者单眼暴露于蓝光（462 nm）2 min，然后再暴露于红光（638 nm）2 min，在2 min的刺激过程中光强度以对数方式逐渐增加，记录刺激眼的瞳孔收缩直径变化。结果发现与健康对照相比，早期青光眼患者的瞳孔收缩幅度减小；这些变化也与青光眼带来的结构损伤相关，如视网膜神经纤维层厚度，在高光强（>12.5 log photons·cm-2·s-1）下，平均视网膜神经纤维层厚度与光照时瞳孔收缩幅度正相关。而视野评分与视网膜神经纤维层厚度没有相关性，说明在早期青光眼患者中，PLR可能更敏感地反映青光眼带来的结构损伤变化。Wang等[26]在青光眼患者和正常对照组中使用匹兹堡睡眠质量指数问卷评估了睡眠情况，发现青光眼患者的睡眠障碍患病率高于对照组。然而睡眠参数和PLR之间没有相关性[27]。青光眼患者的睡眠和情绪障碍可能与ipRGCs介导的昼夜节律紊乱相关[28-29]。因此，彩色光瞳孔测量能够有效反映青光眼产生的视神经损伤程度，有可能作为评估青光眼病情进展的可靠工具。

Feigl等[30]在糖尿病患者中向右眼呈现10 s的488 nm和610 nm的彩色光照刺激，2种光照间隔5 min，记录左眼的瞳孔直径变化。结果发现糖尿病患者的PIPR出现减退，且糖尿病病程与PIPR呈负线性关系，提示ipRGCs功能随着糖尿病病程的延长而逐渐降低。Maynard等[31]对晚期年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）的研究中，使用10 s的红光（604 nm）及蓝光（448 nm）刺激散瞳后的一只眼，间隔55 s，记录对侧眼刺激3 s后瞳孔收缩幅度和刺激消失后6 s的PIPR幅度（%基线瞳孔直径）。使用抑郁自评量表及匹兹堡睡眠质量指数问卷计算抑郁评分和睡眠相关评分。结果发现晚期AMD患者有明显的刺激3 s后瞳孔收缩减少及PIPR幅度降低，且PIPR幅度与患者的睡眠效率评分呈正相关。在前部缺血性视神经病变（Anterior ischemic optic neuropathy,AION）患者中，Tsika等[32]使用暗适应后暗淡蓝光刺激（464±26）nm、光适应后明亮红光刺激（635±20）nm、光适应后明亮蓝光刺激，光照强度以对数增加，先后刺激右眼及左眼。最后同时对双眼进行1 s明亮红光和蓝光刺激，2次光刺激之间有一间隔，使得瞳孔在下一次光刺激前恢复到基线状态，记录患者的瞳孔直径变化。发现受AION影响的眼睛在暴露于明亮蓝色光后PIPR受损。然而在Leber遗传性视神经病变[33-34]及显性视神经萎缩病变[35]中，与健康对照组相比，虽然患者的视觉功能低下，但PLR功能，如蓝光刺激时的瞳孔收缩、明亮蓝光消失后的PIPR未见明显受损，称为瞳孔视觉分离现象（Pupilovisual dissociation）。而相关组织学研究也证明，Leber遗传性视神经病变和显性视神经萎缩中传统的神经节细胞大量丢失，而ipRGCs却相对保留，这与彩色光瞳孔测量的结果互相印证[36]。

作为一种客观、实用和快速的方法，彩色光瞳孔测量正被越来越多地用于视网膜和视神经相关疾病的研究中，在视网膜损伤的定位（位于内层还是外层）中具有重要应用价值。除眼科疾病外，在神经系统疾病如阿尔兹海默症中也有重要应用[37-38]。然而目前彩色光瞳孔测量法仍具有一些局限性。首先，彩色光瞳孔测量相关研究所使用的测量方案不尽相同、具有极大异质性，不同研究的测量结果存在差异，这使得不同研究之间的可比性下降、部分结果缺乏可重复性，从而限制了彩色光瞳孔测量的临床推广与应用。在2017年第32届国际瞳孔会议上，各国专家根据现有知识和经验制定出瞳孔测量的相关标准，并于2019年正式发表[21]。该标准中提出，行彩色光瞳孔测量相关研究时，应报告瞳孔测量设备的基本信息、视网膜的适应状态、光刺激特征以及被检查者的一般信息。其次，Crippa等[38]研究发现，虽然黑视蛋白对光的敏感性不受年龄影响，但外层视网膜对光照的敏感性似乎受年龄影响，儿童比成人需要更亮的红光刺激才能引起视锥细胞相关的PLR。次外，视杆细胞、视锥细胞、黑视蛋白对PLR的贡献仍未完全了解，且不能完全排除存在个体差异的可能性。最后，尽管彩色光瞳孔测量法可用于定位外层或内层视网膜损伤，但是目前尚不能用于判定特定疾病类型。

但不可否认的是，在光照方案的充分标准化之后，彩色光瞳孔测量法能够量化不同视网膜光感受器的功能，反映相关眼科疾病的病理变化，并对疾病的诊断和预后有潜在的预测价值。在动物实验中，通过敲除或修改部分感光细胞的基因，可以实现ipRGCs与视锥、视杆细胞和其他非光敏视网膜神经节细胞的分离。但是在具有完整视网膜功能的人类受试者中难以分离ipRGCs与视锥、视杆细胞的作用。彩色光瞳孔测量法可选择性地刺激人体内不同视网膜光感受器，通过分析相应PLR改变可判断视网膜功能的完整性，这一方法在未来很有可能成为眼科疾病和神经退行性疾病损伤的特定标记方法。此外，彩色光瞳孔测量法操作简单、快速，是一种非侵袭性的检查手段，可用于群体的便携式检测，可能有助于筛查早期视神经及视网膜功能障碍、追踪疾病进展、判断疾病预后，在临床上有着巨大的应用前景，值得进一步研究。

5 小结

ipRGCs位于视网膜内层，内含黑视蛋白，是除视杆细胞、视锥细胞以外的第3 类光感受器细胞。ipRGCs可通过黑视蛋白直接感受光信号，也可被来自视杆、视锥细胞的信号激活，而后将信号传导至OPN，产生PLR。视杆、视锥细胞和黑视蛋白产生的PLR存在差异。视杆、视锥细胞对光照敏感，主要产生快速PLR；黑视蛋白对光照不敏感，产生的PLR更为缓慢和持久。根据不同光感受器的敏感波长和反应阈值不同，开发出彩色光瞳孔测量法，可将PLR中视杆、视锥细胞及ipRGCs的贡献区分开来，可用于评估视网膜或视神经疾病中不同光感受器的功能完整性，从而定位视网膜损伤的位置。目前彩色光瞳孔测量法已在多种眼科疾病中得到应用，然而其具体方案有待进一步优化完善。在未来，这种客观、实用和快速的测量方法有可能成为眼科疾病和神经退行性疾病损伤的特定标记方法，有望成为筛查早期视神经及视网膜功能障碍、追踪疾病进展、判断疾病预后的可靠手段。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明沈士雅：课题设计，资料分析及解释，撰写论文，根据编辑部的修改意见进行修改；竺慧：参与选题、设计，修改论文并参与编辑部修改意见的修改。李蕊、李萧萧：参与选题、设计，修改论文；刘虎：参与选题、设计、资料的分析和解释，参与修改论文中关键性结果、结论，参与编辑部修改意见的修改，给予工作支持