柑橘主要遗传性状的分子标记研究进展

苟文涛 曾莎芮 张志标 陶星星 卓国宁谢岳昌 马瑞丰 杜小珍 李国华

（1 梅州市农林科学院，广东梅州514071；2 梅州市农林科学院果树研究所，广东梅州514071；3 国家柑橘产业技术体系梅州沙田柚综合试验站，广东梅州514071；4 广东省梅州柚品质改良工程技术研究中心，广东梅州514071）

柑橘（Citrus reticulataBlanco.）属芸香科柑橘属，由于其品种繁多、形态各异、口感和风味多样，能满足各类人群的需要，在市场上广受消费者青睐[1-2]。根据联合国粮农组织FAOSTAT 数据显示，2022 年我国柑橘园面积为303.3540 万hm2、柑橘产量为6003.89 万t（约占全球总产量1/3 左右）[3]，国家统计局发布（http：//www.stats.gov.cn/sj/）数据显示中国柑橘栽培面积及柑橘产量常年稳居世界首位。在如此产业背景下，我国的柑橘育种研究得到迅猛发展，种质资源不断创新且数量逐年增加。柑橘是高经济附加值的农作物之一，对提高农民的收入具有重要意义。

柑橘常规育种年限长、效率低且成本高，目前国内的柑橘育种以传统的芽变育种和杂交育种技术为主，分子标记育种还处在起步阶段，未建立完善的柑橘分子标记辅助育种体系。随着近些年分子标记技术迅猛发展，分子标记辅助育种技术（MAS，Marker assisted selcection）为品种创制和选育工作提供了创新思路[4]。分子标记技术以不同物种间核苷酸序列为基础，开展个体间基因差异研究，是解决生物鉴定难的重要手段，其鉴定结果稳定，在精准鉴定易混淆品种近缘种方面具有明显优势。分子标记技术弥补了柑橘类育种研究领域发展的技术短板，在柑橘种质资源鉴定、系统进化、遗传多样性和分子育种等方面能够发挥重要作用。

1 DNA 分子标记技术的概述及类型

DNA 分子标记技术是20 世纪60 年代继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的以遗传物质（核酸）的多态性为基础的遗传标记形式[5]。因其不受植物内部因素（组织类别、发育阶段）和外部环境条件的限制，还具有数量多、分布广、多态性高、稳定性好、检测迅速、操作简便等诸多优势，因而被广泛应用到植物遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析、基因定位等方面[6]。

根据对DNA 多态性的检测方法不同，可将分子标记技术分为4 类[7]：一是基于分子杂交技术的分子标记，如限制性片段长度多态性标记（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）、 可 变数目串联重复多态性（VNTR，Variable number of tandem repeat）等；二是基于PCR 的分子标记，如随机扩增多态性DNA（RAPD，Randomly amplified polymorphic DNA）、特征性片段扩增区域（SCAR，Sequence characterized amplified regions）、简单重复序列（SSR，Simple sequence repeats）、简单序列重复区间扩增多态性（ISSR，Intersimple sequence repeat）、相关序列扩增多态性（SRAP，Sequence related amplified polymorphism）等；三是基于PCR 与限制性酶切技术结合的分子标记，如扩增片段长度多态性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、酶切扩增多态性序列（CAPS，Cleaved amplified polymorphic sequences）等；四是以DNA 序列分析为基础的分子标记，如内转录间隔区（ITS，Internal transcribed spacer）、转录单位间隔区（IGS，Intergenic spacers）、单核苷酸多 态 性（SNPs，Single nucleotide polymorphisms）等。目 前，RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP、SCAR以及SSR 等分子标记技术在柑橘研究中均有报道。

2 DNA 分子标记技术在柑橘中的应用研究

柑橘是一种重要的经济作物，其重要性状包括果实品质、植物生长和抗逆性等。DNA 分子标记技术可用于开发与控制果实品质、植物生长和抗逆性的基因位点相关的分子标记。这些分子标记可以用于选择具有优良性状的柑橘植株，提高育种效率。总之，分子标记开发是柑橘遗传学研究的重要手段，有助于揭示柑橘重要性状的遗传基础，为育种提供指导，促进柑橘遗传改良和品种培育。

2.1 柑橘外在品质相关的分子标记柑橘的外在品质性状除了胚型、花药颜色以外，果实形状、大小和色泽等相关性状是由多基因控制的数量性状，受到内外多种因素的影响，研究难度较大，目前关于其遗传调控的机制尚不清楚[8]。然而，果实大小是柚类的最重要农艺性状之一，不仅影响柚的产量和外观品质，也影响生产成本和消费者的选择。长期以来柚果的外观品质已成为果实品质评价和售价的主要参考指标。Imai 等[9]研究发现，柑橘果实大小介于150～300g 范围内，是理想的柑橘果实大小育种目标。García 等[10]对Citrus volkameriana×Poncirus trifoliata 杂交群体进行遗传分析，检测到Fs1、Fs2和Fs3等3 个与柑橘单果重相关的QTL 位点；Yu等[11]对Fortune 橘×Murcott 橘橙杂交群体进行遗传分析得到48 个与果实品质相关的QTL，其中FW4.2、FW5.1和FW8等3 个QTL 与果实大小相关。罗艾等[12]通过晚蜜2 号×梨橙2 号的94 株F1材料为分离群体探究柑橘果实大小与质量的遗传调控机制，定位到4 个与果实质量相关的QTL，3 个与横径相关的QTL，4 个与纵径相关的QTL，都分别位于WL3 和WL8 连锁群上。在果皮果肉颜色方面，近年来，张亚飞等[13]从柑橘全基因组中鉴定出的CcCCD4a基因与柑橘果肉颜色高度相关，其表达量的高低与果肉颜色深浅变化呈负相关关系。汤雨晴等[14]以红橘与枳杂交F1群体为材料，对果肉色泽和类胡萝卜素代谢进行QTL 分析，定位到与柑橘果肉色泽相关的8 个QTL 位点，并筛选出与色泽高度相关的候选基因Ciclev10019730m和Ciclev10021268m。苑平等[15]利用SRAP 分子标记从克里曼丁红橘芽变植株中克隆到具有差异序列的基因Cs4g12370，推测其可能与果皮色泽调控有关。

2.2 柑橘内在品质相关的分子标记目前，评价柑橘内在品质的指标有香味、苦味、酸味、甜味和质地等[16]。这些风味属性在一定程度上受内源性化学物质影响，如挥发性物质含量决定香味的浓度，类黄酮和柠檬苦素类似物决定果实的苦味，可溶性糖含量决定果肉的甜味，有机酸含量影响果汁的酸味，木质素、果胶、纤维素和半纤维素的含量影响果实的化渣率，氨基酸和异味的醇、醛等物质影响果实的鲜味[1]。随着人们生活水平的提高，市场对不同风味的柑橘需求日益凸显，前人也对柑橘风味进行了一定程度的研究。Asins 等[17]在C.clementinaHort×C.tangerinaHort 群体中，将果实含糖量性状控制位点锁定在9 号连锁群，在可溶性固形物含量和酸度之间存在相关性的情况下，在连锁群9b 和4b 中检测到了2 个性状的QTL，但没有发现QTL 的聚类，这表明连锁至少部分地解释了相关性。张亚飞[18]对柑橘果实GWAS 分析，研究发现CcGLDH与柑橘果实苦味、糖含量、酸含量以及果皮果肉颜色有着紧密的关联。Kita 等[19]以温州蜜柑、葡萄柚、脐橙和酸橙等材料进行苦味调控机理探究时发现LGT基因与苦味性状相关联，进一步研究发现CitLGT-2可以延迟温州蜜柑中的苦味，而CitLGT-1等位基因则可以延迟脐橙果实中的苦味。Fang 等[20]对不同柑橘品种果实酸度进行检测，在无酸柚6 个不同杂交群体中开发了3 个不同的RAPD 连锁标记。江东等[21]通过对低酸和高酸柚群体的Fst 和XPCLR 选择性清除分析，进行柚类果实中决定柠檬酸含量基因的初步定位，定位到7 号染色体上与可滴定酸含量显著关联的SNP 位点。

3 柑橘主要病害相关的分子标记

柑橘病害是导致产量损失和品质下降的主要原因之一。分子标记辅助育种为培育抗病性强、产量高、品质好的品种提供了新的可能性。例如，利用与抗病性相关的分子标记，可以帮助育种家在较短时间内筛选出具有良好抗病性的柑橘品种。近年来，随着各柑橘产区种植面积不断扩大，废弃果园清理不善，柑橘病害日益凸显。同时柑橘极易感染一种或多种病害，从而使得植株生长发育受阻、产量降低、果实品质下降，甚至导致植株死亡。目前，世界上已报道的柑橘病毒和类似病毒病约有80 余种，多具有易传播、危害性大、多种病原复合侵染率高、感染后树体终身带毒和难以防治等特点[22]。我国柑橘常见且危害较大的病害有柑橘黄龙病（HLB，Cirtus huanglongbing）、柑 橘 衰 退 病（CTV，Citrus tristeza virus）和柑橘溃疡病（CBC，Citrus bacterial canker）等[22]。这些病害不但通过苗木转运和芽条嫁接引种进行远距离传播，而且还能在田间通过农事操作和昆虫等进行近距离扩散。目前，针对柑橘病毒类病害尚无有效的防治措施，本文通过对柑橘病毒病相关的分子标记研究进展进行概述，为柑橘病毒病的快速诊断和抗病性研究提供参考。

3.1 黄龙病分子标记柑橘黄龙病是一种严重影响柑橘产业的重要病害，给全球柑橘产业带来了巨大的损失。为了应对柑橘黄龙病的威胁，研究者们正在努力探索与之相关的分子标记。Chen 等[23]首次利用简单重复单位（AGACACA）证明了佛罗里达州和中国广东省黄龙病菌株存在显著差异。Katoh 等[24]利用可变数目的串联重复序列（VNTR，Variable number of tandem repeats）构建黄龙病的SSR 标记，成功筛选到27 个具有4～63 个核苷酸的SSR 分子标记，为黄龙病遗传多样性研究奠定基础。Matos 等[25]用其中4 个SSR 分子标记分析黄龙病新流行区的菌株，发现佛罗里达州南北的菌株存在差异。Ming 等[26]在枳遗传图谱LG6、LG8 和LG9 以及甜橙遗传图谱LG7 上，分别鉴定到4 个HLB 诱导叶片和冠层反应的QTL，揭示多个QTL参与柑橘HLB 反应的遗传控制，为今后研究HLB抗性或耐受性的遗传结构提供了一个起点。目前，对于柑橘黄龙病分子标记的研究还处于初级阶段，尚未有成熟的分子标记应用于育种实践。未来的研究需要进一步探索这些基因及其作用机制，以便更好地理解柑橘黄龙病的发病机理，并找到更有效的育种策略来应对这种病害的威胁。

3.2 衰退病分子标记柑橘衰退病是一种由线性病毒引起的严重病害，其既是植物病毒中基因组最大的病毒，也是编码RNA 沉默抑制子较多的病毒之一[27]。加强植物检疫，选用抗病性强的品种作为砧木，加强栽培管理，及时防治蚜虫等措施都是有效预防衰退病的方法。在选育品种时，利用分子标记辅助育种可以帮助选择具有良好抗病性的品种。Mestre 等[28]采用BSA 方法对枳的衰退病进行遗传分析，找到7 个RAPD 标记，并将这些RAPD 连锁标记转化成SCAR 标记。Deng 等[29]克隆了柑橘NBS-LRR 类抗病基因，并成功定位到3 个与衰退病连锁的CAP 标记（18P33a、Pt9a 和Pt8a）。Asins等[30]利用病毒积累的QTL 分析研究CTV 与柑橘的互作效应，从中筛选定位到3 个QTL（CTV-A1、CTV-A3和CTV-A5）及其候选基因；后来，Asins等[31]又找到了4 个与抗CTV 相关的候选基因位点（CTVCh14、CTVCh15、CTVCh17和VIC）。 虽 然柑橘衰退病的分子标记研究还面临许多挑战，但随着分子生物技术的不断发展和应用，未来的研究有望为柑橘育种提供更多的工具和方法。通过探索和利用分子标记，可以更好地了解和控制柑橘衰退病的遗传基础，从而提高品种的抗病性和市场竞争力。

3.3 溃疡病分子标记柑橘溃疡病是一种由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种引起的细菌性病害。柑橘溃疡病的主要症状包括植株叶片、果实和枝条上出现褪绿的斑点，随后这些斑点会扩大并变成黄色的溃疡状，最终导致这些部分脱落[32]。在柑橘溃疡病研究方面，Xiang 等[33]通过类受体激酶的候选抗病基因序列，发现了与柑橘溃疡病抗性密切相关的分子标记位点。彭祝春等[34]通过构建抗性分离群体进行田间抗性测试，再结合SSR 分子标记技术，筛选并验证了与柑橘溃疡病抗性相关的分子标记，得到1 个与柑橘溃疡病抗性相关的分子标记CCR-110。对于柑橘溃疡病的分子标记研究，目前还相对较少。然而，已有一些研究表明，可能与某些基因有关，这些基因可能涉及到抗病性、耐病性以及与病毒的互作等方面。总的来说，对于柑橘溃疡病的分子标记研究目前尚未得到足够的关注，需要更多研究者共同努力来推动这一领域的发展。随着分子生物技术的不断发展和应用，未来的研究有望能够更深入地了解和应对柑橘溃疡病的威胁。

4 柑橘抗逆性相关的分子标记

柑橘抗逆性是指柑橘植株在逆境条件下仍然能够正常生长和繁殖的能力，这种能力受到许多因素的影响，包括柑橘植株的基因型、环境因素、土壤和气候条件等[35]。在柑橘抗逆性的分子标记研究方面，一些研究者正在致力于寻找与抗逆性相关的分子标记。这些分子标记可能涉及到多个基因和蛋白质，包括与细胞保护、抗氧化、抗炎和免疫反应等相关基因。例如，在柑橘耐冷性状研究方面，Weber等[36]使用柚和枳杂交F1群体，检测到3 个与抗低温相关的QTL；马喜军[37]运用电导法进行抗寒力测定，检测到7 个与抗寒性相关的QTL，分别分布于LW1、LW2、LW3 和LW8 连 锁 群 上。Hong等[38]在LG1、LG2、LG3 和LG4 上检测到4 个抗寒性相关的QTL（qFT1.1/2.1/3.1/4.1），可解释较多的表型变异。Abouzari 等[39]研究发现了与柑橘耐冷能力相关的SSR 和AFLP 分子标记，并且其中的一些分子标记与植株的超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量相关。在柑橘耐盐性状研究方面，Kolstad[40]以枳和柚的BC1群体为材料，在盐和非盐环境中进行Na+和Cl-积累相关性状的QTL 分析，发现了73 个潜在数量性状位点。Raga 等[41]对柑橘砧木Trifoliata 和CleopatraMandarin 的杂交后代进行遗传研究，通过区间定位和多QTL 定位共检测到98 个与耐盐性相关的QTL。在柑橘耐旱性状研究方面，肖金平等[42]通过cDNA-AFLP 方法筛选到干旱胁迫下柑橘叶片中的差异表达基因TDF；此外，卢婷等[43]研究表明WRKY75基因受多种非生物胁迫诱导表达，推测其可能在柑橘响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用。李潇等[44]研究发现，甜橙CsMYB96能被低温和干旱胁迫诱导表达。柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96在高盐胁迫下被诱导表达，而芦柑CrMYB96的表达量在低温、干旱和高盐胁迫下都有不同程度的下调表达。

5 结语与展望

在过去的半个多世纪以来，我国的柑橘育种进程逐渐加快，先后经历了4 个重要的育种时代，即利用自然变异时代（V1.0）、杂交产生变异时代（V2.0）、生物技术育种的细胞水平时代（V3.0）和分子水平时代（V4.0）。从最初的芽变选育时代到分子育种时代，柑橘育种进程呈现快速发展趋势[3]。然而，由于柑橘类型繁多、形态复杂且易发生芽变，其模糊的遗传背景在一定程度上阻碍了柑橘类的育种进程。此外，由于实生苗生长速度缓慢，导致育种年限长、育种效率低。

分子标记能够直接鉴别生物个体间的本质差异，不受时间和空间的限制。但是当前大多数分子标记还停留在实验室阶段，距离实际应用还有较大距离，并且在实际应用中简单照搬就可以使用的分子标记并不多见。因此需要应用分子标记技术深入研究柑橘的重要性状，详细可靠地对其遗传规律进行分析，并开发与重要性状紧密连锁的分子标记利用分子标记辅助基因聚合育种，将控制不同优良性状的基因聚合，有效缩短选育周期，培育柑橘新种质。

未来的研究将更加关注于寻找与品质和抗病性相关的分子标记。分子标记技术与蛋白组、代谢组等生物技术相结合，更深入地了解品质和抗病的机制。同时，柑橘品种选育要以消费者的需求为目标，新品种创制应朝着优质多元化方向发展。在果实品质提升方面，深入挖掘易剥皮、无籽、有香味、风味浓等相关性状的分子标记。在满足柑橘周年化市场供应需求方面，找寻与早、中、晚熟品种相对应的分子标记。还需要积极探索适合机械化栽培的柑橘砧木和接穗品种，如开发矮化、直立树形和枝条无刺等性状相关的分子标记。此外，还应利用分子标记辅助育种筛选高抗性柑橘品种，特别是高抗黄龙病的品种或砧木。