贵州都匀仙女虾的分子鉴定

姚俊杰，何浩宇，陈 江，纪 达，张书海

(贵州大学 渔业资源与环境研究中心，贵州 贵阳 550025)

仙女虾(fairy shrimps)是节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，鳃足亚纲(Branchiopoda)，无背甲目(Anostraca)一类物种的总称[1]。这类物种是典型的临时池塘栖息者，它们通常生长和成熟都很快，以适应短暂的生长季节，生命周期一般在1～3个月[2]。仙女虾在甲壳纲动物的分类单元中是最具多样性的[3]，在世界范围内有10科300多个物种[4]。目前，仙女虾作为养殖鱼虾的饲料受到了一些关注[5-6]，但是由于仙女虾的新种还在不断出现，仙女虾的形态学鉴定方面主要局限于成体，并且对于仙女虾的物种鉴定主要依据显著的几个形态特征来进行区分，如钗额虫科物种主要依据雄性第二触角和前附肢进行区分[7]，而弯头虫科主要依据雄性触角和四面体的卵来区分[8]，除了这些显著的形态特征之外，其他定性和定量的形态特征往往被忽视，对形态相似的近缘种难以进行有效鉴定[9]。

随着分子生物学技术的发展和不断完善，分子鉴定理论和技术已被广泛应用于动物分类学研究领域。其中，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)已被广泛采纳为通用的标准条形码基因片段，在仙女虾系统分类中得到应用。例如Luki等[10]利用COI基因和其他基因片段对仙女虾Branchipusschaefferi进行了系统发育分析，确定了B.schaefferi的四个主要进化分支。Ketmaier等[11]采用COI基因序列分析了意大利仙女虾属Chirocephalus的6个物种间的遗传分化水平。

16SrRNA长度适中，具有较高的保守性，进化速度相对缓慢，能提供足够的信息，相比于COI基因，16SrRNA基因序列片段较易扩增[12]，是一种可靠的用于分子鉴定的核基因片段。16SrRNA是常被用于系统发育和生物多样性研究的一种重要分子标记。例如，Takahashi等[13]使用16SrRNA与COI基因对日本北部(Shiretoko和Chokai)以及俄罗斯远东地区(Khanka)的Eubranchipusasanumain.sp.、Eubranchipushatanakain.sp.和Eubranchipuskhankanusn.sp.进行了分子鉴定，以分子数据描述了这3个仙女虾新种。Deiner等[14]使用16SrRNA与COI基因对春池仙女虾(Branchinectalynchi)进行了测序，分析了物种分布范围内的区域种群结构和潜在管理单元。

2021年9月在贵州省都匀市甲登村一池塘内发现一种仙女虾，通过形态观察，并以线粒体COI基因和16SrRNA基因片段进行序列测定和比对分析，对该仙女虾物种进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

本材料于2021年9月30日采自黔南布依族苗族自治州都匀市坝固镇甲登村一池塘内(N26°17′33.08″，E 107°44′46.79″)，池塘面积15 m×20 m，水体颜色呈绿色，水质情况为氨氮：0.5 mg/L，亚硝酸盐：0.005 mg/L，硬度：14.06，溶氧：5.2～5.4 mg/L。捕获的仙女虾样品浸泡于无水乙醇溶液中，-20 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA的提取

取仙女虾泳足组织约20～30 mg，用蒸馏水洗净泳足中的酒精，将其剪碎，采用组织基因组提取试剂盒(重庆擎科生物科技有限公司)提取总DNA，获得的DNA样品采用分光光度计检测，取OD值在1.9以上的样品，置于1.5 mL离心管中-20 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增及序列测定

线粒体COI基因与16SrRNA基因的扩增引物均为通用引物，线粒体COI基因的引物为COIF(5′-CGAGCAGAGTTAGGTCAACCTG-3′)，COIR(5′-GGAAGAGAGAGGAGTAAGAGAACTGC-3′)，16SrRNA基因的引物为16SrRNAF(5′-CTTTTAT-CTTTTTAAGG TCTGGCCT-3′)，16SrRNAR(5′-TA-GGAATTTAATAGTCGAACAGACTACC-3′)。所有引物均由重庆擎科生物科技有限公司合成。PCR扩增的反应体系为25 μL，包括22 μL金牌mix(重庆擎科生物科技有限公司生产)，10 μmol/L的正、反引物各1 μL，DNA模板为1 μL。PCR反应程序为:98 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃终延伸1 min。每次PCR扩增均设置阴性对照，以防外源DNA分子的污染。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，将胶置于UVP全自动凝胶成像系统上观察产物长度与浓度，选取条带亮且单一的PCR原液送至重庆擎科生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.3数据分析

采用NCBI在线BLAST进行相似性比对分析，以确定扩增序列的种类。将试验所得序列与GenBank中下载的同源序列利用ClustalX1.81软件进行排序[15]。采用MEGA v6.0 软件将COI和16SrRNA基因序列翻译成蛋白序列，检测是否有提前终止现象，计算碱基含量和遗传距离，并构建邻接(neighbor-joining，NJ)分子系统树，系统树各分支的置信度由Bootstrap 1000次循环检验[16]。

2 结果与分析

2.1 形态特征描述

本试验捕获了50尾都匀仙女虾，经观测，该仙女虾体透明，平均体重为0.018±0.07 g，平均全长15.67±1.99 mm，第一触角两根，长度约0.28 mm，第二触角长约0.02 mm，眼睛一对，突出，尾呈橘红色，呈Y形，长约0.24 mm，边缘密生刚毛。以仰泳的方式在池塘中游动(图1)。

注：a.都匀仙女虾背面图;b.都匀仙女虾尾部(×10)。图1 都匀仙女虾形态图Fig.1 The shape of fairy shrimp in Duyun

2.2 PCR扩增及电泳检测

对贵州都匀仙女虾的COI和16SrRNA序列区进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，分别得到1条长度约为470 bp和750 bp的目的产物(图2)。

注：M.DL2000 DNA分子量标准；A.引物A扩增出的COI序列；B.引物B扩增出的16S rRNA序列。图2 仙女虾COI 基因与16S rRNA基因的PCR扩增条带Fig.2 PCR amplification bands of COI gene and 16S rRNA gene in the fairy shrimps

2.3 COI、16S rRNA区基因的同源性对都匀仙女虾的鉴定分析

测序获得的贵州都匀仙女虾COI基因与16SrRNA基因片段序列利用NCBI数据库中的BLAST，与GenBank中已有仙女虾的COI、16SrRNA基因序列进行多序列比对，发现贵州都匀仙女虾与钗额虫科(Thamnocephalidae)的鹄沼枝额虫(Branchinellakugenumaensis)的COI基因序列(LC311764.1)相似性达到了98.71%，与鹄沼枝额虫的16SrRNA的基因序列(LC311765.1)相似性达到了98.96%。从同源性分析鉴定来看，都匀仙女虾可初步确定为钗额虫科的鹄沼枝额虫。

2.4 基于COI区基因的遗传距离与系统进化树对都匀仙女虾的鉴定分析

基于COI基因序列计算的不同仙女虾遗传距离见表1。都匀仙女虾与不同仙女虾物种的遗传距离在0.017～0.238之间，其中与在日本发现的鹄沼枝额虫(Branchinellakugenumaensis)遗传距离仅为0.017，与弯头虫科的Streptocephalusdorothae遗传距离最大，为0.238。基于COI基因的序列分析表明，都匀仙女虾为钗额虫科的鹄沼枝额虫。

选取弯头虫科的Streptocephalusdorothae为外类群，基于COI序列以邻接法构建系统发育树(图3)，结果发现贵州都匀仙女虾与同为枝额虫属的Branchinellalongirostris、Branchinellaspinosa为同枝系，验证了都匀仙女虾为枝额虫属(Branchinella)，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫聚为一支，置信度为100%，表明都匀仙女虾为枝额虫属的鹄沼枝额虫。

图3 基于 COI 基因序列构建的不同仙女虾物种的邻接分子系统树Fig.3 The NJ tree of different fairy shrimp species with the COI gene sequences

2.5 基于16S rRNA区基因的遗传距离与系统进化树对都匀仙女虾的鉴定分析

基于16SrRNA基因序列计算的不同仙女虾遗传距离见表2。都匀仙女虾与其他不同仙女虾物种遗传距离范围在0.000～0.179之间，其中与鹄沼枝额虫遗传距离最小，为0.000；与弯头虫科的Streptocephalusdorothae遗传距离最大，为0.179。基于16SrRNA基因序列分析，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫的遗传距离为0.000，表明都匀仙女虾为钗额虫科的鹄沼枝额虫。

表2 基于16S rRNA基因序列计算的不同仙女虾遗传距离Tab.2 Genetic distance of different fairy shrimps calculated based on 16S rRNA gene sequence

选取弯头虫科的Streptocephalusdorothae为外类群，基于16SrRNA序列以邻接法构建系统发育树(图4)，结果发现都匀仙女虾与同为枝额虫属的Branchinellapinderi、Branchinellalamellata、Branchinellatyleri、Branchinellasimplex为同枝系，都匀仙女虾也归于枝额虫属。都匀仙女虾与鹄沼枝额虫聚为一支，置信度为99%，也表明都匀仙女虾为枝额虫属的鹄沼枝额虫。

图4 基于16S rRNA基因序列构建的不同仙女虾物种的邻接分子系统树Fig.4 The NJ tree of different fairy shrimp species with the 16S rRNA gene sequences

3 结论与讨论

3.1 COI与16S rRNA基因在分子鉴定中的应用

分子鉴定作为形态学鉴定方法的补充手段，被越来越多的水产学者所接受，本研究所采用的COI基因被广泛用于物种的分子鉴定，自COI基因作为DNA条形码概念的提出，更是成为物种的分子鉴定与系统发育研究的热门基因片段。陈媛[17]对蚁属(Formica)16个种进行形态鉴定与COI基因测序发现，COI基因可以克服形态分类上的局限性，有利于隐藏种的发现以及地方基因多样性的评估。

COI基因作为遗传标记能很好的鉴定物种，但由于COI基因是母系遗传，有着条形码数据与物种边界不一致的潜在原因：分类不完善、遗传信息不充分、谱系分类不完整或亲缘杂交[18]。众多学者也提到单独使用COI基因序列的有限性[19-20]，因此为防止COI基因不能对物种进行有效的鉴定，需结合其他分子标记深入分析。16SrRNA是一种核糖体基因，能够很好的反映各物种种属的进化，多用于种属鉴定、进化分析等方面[21-23]。例如，Iguchi[21]利用核基因16SrRNA序列鉴定了日本各地深海腹足纲(Buccinum)物种的种间和种内关系。因此，本研究采用线粒体COI基因和核基因16SrRNA基因测序两种方法对都匀仙女虾进行鉴定。

3.2 COI与16S rRNA基因鉴定的有效性与都匀仙女虾可能存在的进化关系

物种种间和种内遗传距离的大小是进行物种鉴别的主要标准。Hellberg等[24]曾提出使用COI基因进行物种鉴别研究时，认为种内的遗传距离不得大于2%，至少为同属内种间遗传距离的10倍以上才可有效判别物种。基于COI基因的序列分析，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫的遗传距离为0.017，同属内种间遗传距离平均0.252，种间遗传距离是种内遗传距离的14.85倍，同属种间遗传距离和种内距离有明显的间隔区，这一结论初步表明都匀仙女虾与鹄沼枝额虫属于同一物种。而基于16SrRNA基因序列的都匀仙女虾与鹄沼枝额虫的遗传距离为0.000，小于Hebert等[25]计算的甲壳纲同属物种间的平均遗传距离(0.154)，属于种内差异，表明都匀仙女虾为钗额虫科的鹄沼枝额虫。构建邻接分子系统树均显示都匀仙女虾与鹄沼枝额虫聚为一支，COI树与16SrRNA树的节点支持率分别为100%和99%，说明这两个节点为独立分支的结果均可靠。综上所述，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫属于同一物种的结论是可信的。

值得注意的是，在基于16SrRNA基因序列构建的遗传距离表中，都匀仙女虾与仙女虾Branchinellalamellata的遗传距离较近(0.159)，说明两种仙女虾亲缘关系较近，存在可能的进化关系，需要结合其他基因进一步分析。

3.3 仙女虾鹄沼枝额虫的物种保护与应用

鹄沼枝额虫是1895年在日本石川县首次被发现及描述的无背甲目物种[26]，俗称古根丰年虫，隶属于钗额虫科枝额虫属，为淡水仙女虾，自然分布于中国、日本、朝鲜及印度南部等淡水水域[27]。由于临时池塘被迅速摧毁，仙女虾在全球范围内被认为是一个脆弱的群体，其分布不断下降[28]。美国濒危物种法已将仙女虾列为濒危物种，为了应对这一挑战，美国“濒危物种恢复计划”要求实施以遗传数据为依据的再引进计划，以恢复灭绝的种群[29]。此次发现的鹄沼枝额虫出现在都匀市甲登村的池塘中，才有机会采到样品，对其进行鉴定和分析。由于农药、化肥的施用，目前池塘等水体中，仙女虾出现的频率很低。需要对鹄沼枝额虫等仙女虾进行必要的保护，一方面，可以进一步认识这个物种的相关生物学特性，另一方面利于保护我国水生生物的多样性。

盐水丰年虫(Artemiasalina)是应用较多的一种仙女虾，其虫卵即卤虫，卤虫含有丰富的蛋白质，氨基酸组成齐全，粗脂肪含量比较高，其中不饱和脂肪酸高于饱和脂肪酸，带壳卵的不饱和脂肪酸为48.15%，脱壳卵的为54.82%。带壳卵的饱和脂肪酸是脱壳卵的1.5倍[30]，卤虫卵是鱼、虾常用的开口饵料，如用作南美白对虾(LitopenaeusVannamei)[31]、脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)[32]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[33]等的开口饵料。

鹄沼枝额虫是淡水种类的仙女虾，同样是高蛋白、高氨基酸含量的生物饵料[34]，而其幼体是青虾(Macrobrachiumnipponense)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、圆尾斗鱼(Macropodusocellatu)等淡水水产动物苗种培育的优质开口活饵，有巨大的养殖利用价值[34-35]。