三阴性乳腺癌组织H3K4me3、H3K9ac 表达与临床病理特征和预后的关系

高平发，吴炜，冯东旭，谷佃宝，费哲为

上海健康医学院附属崇明医院甲乳外科，上海 202150

乳腺癌是女性发病率最高、致死率第二的恶性肿瘤［1］。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种特殊类型的乳腺癌，占所有乳腺癌的10.0%～20.8%。由于雌激素受体、孕激素受体以及表皮生长因子受体2（Her-2）表达均为阴性，TNBC缺乏有效的治疗靶点，目前的治疗策略仍以化疗为主，治疗效果较差［2-3］。因此，深入研究TNBC 的发病机制可能对探索新的治疗策略具有重要意义。表观遗传改变，如DNA 甲基化和组蛋白翻译后修饰，已被证实能够影响基因的表达［4］。组蛋白翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等，这些修饰方式均与基因表达调控密切相关。组蛋白H3 第4 位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）是由组蛋白甲基转移酶介导，能够导致肿瘤相关基因转录激活。组蛋白H3 第9 位赖氨酸残基乙酰化（H3K9ac）作为转录激活剂，能够增强多种信号通路而促进肿瘤的发生、发展［5］。有研究报道，乳腺癌组织H3K4me3、H3K9ac 高表达，其高表达与患者预后不良有关［6］。本研究探索了TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达与临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016 年1 月—2019 年4 月上海健康医学院附属崇明医院收治的TNBC 患者145例。TNBC 诊断依据《中国临床肿瘤学会（CSCO）乳腺癌诊疗指南》，并经术后病理检查明确诊断。纳入标准：①符合原发性TNBC 诊断标准；②单侧发病；③初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；④接受乳腺癌改良根治术+腋窝淋巴结清扫术。排除标准：①存在远处转移者；②合并其他部位肿瘤者；③合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者；④妊娠期或哺乳期。患者年龄32～62 岁，其中≤50 岁84 例、＞50 岁61 例；绝经41例，未绝经104例；肿瘤直径≥2 cm 56例，肿瘤直径＜2 cm 89例；病理类型：浸润性导管癌109例，浸润性小叶癌10例，髓样癌5例，其他癌21例；T分期：T1期58例，T2～T4期87例；N分期：N0期49例，N1、N2期96 例；组织分化程度：高分化62 例，中分化54 例，低未分化29例。本研究经上海健康医学院附属崇明医院伦理委员会批准（审批编号：20162104），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 H3K4me3、H3K9ac、Ki-67表达检测 采用PV-6000 二步法行免疫组化染色。取手术切除的TNBC组织，4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4～6 μm 厚连续切片。切片57～60 ℃烤片60 min，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶活性。然后将切片置于柠檬酸盐缓冲液中，置于微波炉中加热修复抗原，自然冷却至室温。经正常山羊血清封闭后，分别滴加H3K4me3、H3K9ac、抗Ki-67 多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。次日，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育60 min。DAB 显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，常规脱水、透明，中性树胶封固，显微镜下拍照观察。

结果判定：H3K4me3、H3K9ac 阳性染色均定位于细胞核，呈浅黄色至棕褐色颗粒。染色强度评分：以阳性细胞呈色反应为准，无色为0 分，浅黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。每张切片随机选取5个400倍不重叠视野，计数每视野阳性细胞和细胞总数，计算阳性细胞比例。阳性细胞比例评分：≤10%为0 分，＞10%～25%为1 分，＞25%～50%为2分，＞50%为3 分。根据染色程度和阳性细胞比例半定量分析，染色程度评分与阳性细胞比例评分乘积≥1 为阳性表达，其中二者乘积0～3 为低表达、4～6为高表达。Ki-67阳性染色定位于细胞核，呈浅黄色至棕褐色颗粒。Ki-67 表达强度采用阳性细胞比例评估。每张切片随机选取5个400倍不重叠视野，计数每视野阳性细胞和细胞总数，计算阳性细胞比例。阳性细胞数≤5%为阴性，＞5%～10%为弱阳性，＞10%～50%为阳性，＞50%为强阳性。

1.3 随访 所有研究对象出院后以电话形式定期随访3 年，出院后第1 年每3 个月随访1 次，之后每6个月随访1次，以患者死亡或随访3年结束为随访终点，统计患者生存情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验，等级资料比较采用秩和检验。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达情况 145例份TNBC 组织中，H3K4me3 高表达84 例份、低表达61例份，H3K9ac高表达78例份、低表达67例份。

2.2 TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达与临床病理特征的关系 见表1。

表1 TNBC组织H3K4me3和H3K9ac表达与临床病理特征的关系［例（%）］

2.3 TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达与Ki-67 表达的关系 经秩和检验，随着Ki-67 表达强度增加，TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 阳性表达逐渐增多（Z分别为3.630、3.168，P均＜0.05），见表2。

表2 TNBC组织H3K4me3、H3K9ac表达与Ki-67表达强度的关系［例（%）］

2.4 TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达与患者预后的关系 TNBC组织H3K4me3高表达者与低表达者3年累积生存率分别为60.7%、78.7%，TNBC组织H3K4me3高表达者3年累积生存率显著低于其低表达者（χ2=3.023，P＜0.05）；TNBC组织H3K9ac高表达者与低表达者3 年累积生存率分别为58.3%、82.0%，TNBC组织H3K9ac高表达者3年累积生存率显著低于其低表达者（χ2=3.023，P＜0.05）。

3 讨论

TNBC是一种雌激素受体、孕激素受体以及Her-2表达均为阴性的乳腺癌。流行病学调查显示，TNBC多发生于40岁以下的绝经前女性［7］。与其他类型乳腺癌相比，TNBC易复发和转移，病情进展迅速，并且缺乏有效的治疗靶标，预后较差。目前，TNBC发病的分子机制仍不十分清楚。因此，深入研究TNBC的发病机制可能对探索新的治疗策略具有重要意义。

表观遗传是指DNA 序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。表观遗传改变，如DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰等，通常发生在肿瘤发展的早期阶段［8］。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰过程，在过去几年中引起了较大关注。组蛋白修饰发生在细胞核或细胞质中，翻译后可调节DNA 的结构和复制，在细胞周期中发挥作用［9］。异常组蛋白修饰可导致基因表达和细胞整体代谢状态改变，从而引起多种疾病。已有研究证实，组蛋白甲基化、乙酰化与乳腺癌的关系非常密切［10］。H3K4me3 处的三甲基化是一种翻译后组蛋白修饰，H3K4me3 异常可导致表观遗传改变，这些表观遗传改变能够引起肿瘤相关蛋白表达变化，从而促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移［11］。有研究报道，H3K4me3 改变能够激活与乳腺癌细胞增殖和侵袭相关的基因，从而促进乳腺的发生、发展［12］。组蛋白乙酰化可通过中和组蛋白的正电荷来改变静电荷，组蛋白尾部整体乙酰化可减少碱性赖氨酸残基与带负电荷DNA的静电作用。因此，组蛋白乙酰化可诱导常染色质形成，使常染色质变得更加开放，使基因转录变得活跃，从而诱导肿瘤发生。H3K9ac作为转录激活剂，能够增强多种信号通路而促进肿瘤的发生、发展［5］。有研究报道，乳腺癌组织H3K4me3、H3K9ac高表达，其高表达与患者预后不良有关［6］。但目前关于TNBC组织H3K4me3、H3K9ac 表达与临床病理特征和预后关系的报道相对较少。

本研究结果显示，145 例份TNBC 组织中，H3K4me3 高表达84 例份、低表达61 例份，H3K9ac高表达78 例份、低表达67 例份，提示TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 高表达，与以往在乳腺癌中的报道一致［6］。进一步研究发现，TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达均与T 分期、N 分期和组织分化程度有关，而与年龄、绝经状态、肿瘤直径、病理类型无关。结果提示，H3K4me3、H3K9ac 表达与TNBC 侵袭和转移密切相关。在TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 表达与Ki-67 表达强度关系的分析中，随着Ki-67 表达强度增加，TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 阳性表达逐渐增多。进一步证实H3K4me3、H3K9ac 高表达与TNBC 进展密切相关，与KAUKONEN 等［13］研究报道一致。生存分析发现，TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 高表达者3 年累积生存率均显著低于其低表达者，提示H3K4me3、H3K9ac 高表达与TNBC 患者预后不良有关。以上研究结果提示，抑制H3K4me3、H3K9ac 表达有望成为改善TNBC 预后的策略之一［14-16］。

综上所述，TNBC 组织H3K4me3、H3K9ac 高表达，其高表达与肿瘤侵袭、转移以及患者预后不良密切相关。