升血小板胶囊对小鼠免疫性血小板减少症的治疗作用及其机制

刘建强，侯圣贵，李晓燕，窦爱霞

1 济南市第四人民医院关节外科，济南 250032；2 济南市第四人民医院药学部；3 山东大学第二医院血液科

免疫性血小板减少症（ITP）是一种因血小板减少导致的出血性疾病［1］。研究证实，ITP患者存在免疫耐受机制异常，调节T 细胞（Tregs 细胞）的免疫抑制功能降低，血液中循环促炎症细胞因子水平升高。ITP 治疗过程中需要应用免疫抑制剂，如糖皮质激素类药物。但是老年患者应用糖皮质激素治疗过程中，往往出现高血压、高血糖、骨质疏松、感染等严重不良反应。因此，如何减少ITP 患者治疗过程中的药物不良反应十分重要。2020年1月—2022年1月，我们制作ITP小鼠模型并选择升血小板胶囊治疗；通过观察模型小鼠治疗过程中血小板数目、免疫细胞以及炎症因子的变化，探讨升血小板胶囊对ITP的治疗作用及减少不良反应的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 4～6周龄雌性C57BL/6J近交系小鼠购自山东大学实验动物中心，体质量平均为0.020 kg。升血小板胶囊由陕西郝其军制药股份有限公司提供（批号：2208116；规格：每盒24粒，每粒0.45 g）。强的松片（每片5 mg）溶于生理盐水中制成0.45 mg/mL浓度的药液待用。大鼠抗小鼠CD41（血小板抗体，克隆号MWRG30）购自美国BD 公司，按照产品说明用生理盐水配制成一定浓度的药液。小鼠Tregs 细胞分 离 试 剂 盒 购 自Invitrogen 公 司（Carlsbad，CA，USA），小鼠Tregs 细胞流式检测试剂盒购自eBioscience公司（San Diego，CA，USA）。

1.2 ITP 小鼠模型构建及分组处理 动物实验依据美国实验动物资源研究所颁布的《实验动物饲养和使用手册》进行，实验记录编号为KYLL-2021（KJ）A-0046。将40 只小鼠适应性喂养1 周后，随机分为对照组、模型组、胶囊组、强的松组，每组10 只。除对照组外，其余三组均用抗血小板抗体于小鼠腹腔内注射，诱导持续性血小板减少成功建立ITP 模型。对照组、模型组按照10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，强的松组按照10 mg/（kg·d）给予相同体积的强的松溶液灌胃，胶囊组按体质量4.5 g/（kg·d）给予相同体积的升血小板胶囊溶液灌胃。各组灌胃均每日1 次，连续8 d。如未经治疗，ITP 模型维持时间为4～7周，选择4周处死动物。

1.3 ITP 小鼠模型外周血小板计数、骨髓液涂片染色 用药4 周分别处死动物。先摘眼球取血，进行血小板计数测定。然后取右侧股骨，分离骨髓，取骨髓液涂片，晾干后做瑞氏-姬姆萨染色。

1.4 小鼠脾脏Tregs细胞构成检测 采用流式细胞仪检测。无菌操作取脾脏淋巴结，制备ITP 小鼠单个核细胞悬液，检测Tregs 细胞构成比例。主要步骤：按照磁珠分选试剂盒步骤取所需体积磁珠移入玻璃试管，加入等体积或至少1 mL 的分离缓冲液，震荡混匀后在磁场中静置2 min，弃上清后等体积分离缓冲液重悬磁珠。收集各组脾脏和引流淋巴结提取的单个核细胞，分离CD4+T 细胞。分离到的CD4+T 细胞中加入抗CD25 抗体室温孵育20 min，预冷，分离缓冲液2 mL清洗，离心、重悬，加入75 μL清洗Flow Comp 磁珠，室温振荡孵育15 min。置于磁场中2 min，上清取出后用2 mL 分离缓冲液重悬沉淀，再次置于磁场2 min，弃上清。移出磁场后加入0.5 mL 洗脱液重悬细胞，室温振荡孵育20 min。轻柔吹打后移入磁场，静置2 min，分别计数CD4 细胞和CD4+CD25+T 细胞，CD4+CD25+T 细胞即为Tregs 细胞，计算Tregs 细胞构成比及Tregs/CD4 值。实验重复3次。

1.5 小鼠脾脏T 细胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA 检测 采用流式细胞仪以检测Tregs 细胞类似步骤检测小鼠脾脏CD4+CD25-效应T 细胞（即Teff 细胞）。TRIzol 试剂盒提取Teff 细胞总RNA，按照反转录试剂盒操作说明书反转录为cDNA，然后进行PCR 扩增，检测Teff 细胞IL-2 mRNA 表达。实验重复3 次，每次反应均做空白对照（不加模板的反应系统）以排除污染。同样方法提取Tregs 细胞的总RNA，检测Tregs细胞Foxp3 mRNA表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件。计量资料符合正态分布用± s表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠外周血小板计数 对照组、模型组、强的松组、胶囊组小鼠外周血小板计数分别为（600.35 ± 145.39）、（123.33 ± 16.24）、（327.66 ± 73.20）、（577.35 ± 76.94）×109/L。与对照组比较，模型组、胶囊组、强的松组小鼠外周血小板计数均有不同程度下降（P 均＜0.05）；与模型组比较，胶囊组、强的松组小鼠外周血小板水平升高（P 均＜0.05）；胶囊组与强的松组比较，外周血小板水平差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组小鼠骨髓涂片产板巨核细胞计数 对照组、模型组、强的松组、胶囊组小鼠骨髓产板巨核细胞计数分别为（55.05 ± 5.83）、（26.90 ± 2.49）、（66.27 ± 3.58）、（63.45 ± 3.44）个，与对照组比较，模型组小鼠骨髓产板巨核细胞数下降（P＜0.05）；与模型组比较，胶囊组、强的松组ITP 小鼠骨髓产板巨核细胞数增加（P均＜0.05）。胶囊组、强的松组小鼠骨髓产板巨核细胞数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠脾脏Tregs 细胞构成及Tregs/CD4值 与对照组比较，模型组小鼠Tregs细胞构成比及Tregs/CD4 值下调（P均＜0.05）；与模型组比较，胶囊组、强的松组小鼠Tresg 细胞构成比及Tregs/CD4 值上调（P均＜0.05）。胶囊组、强的松组小鼠Tregs 细胞构成及Tregs/CD4 比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠Tregs细胞构成比及Tregs/CD4比较（%± s）

表1 各组小鼠Tregs细胞构成比及Tregs/CD4比较（%± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

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2.4 各组小鼠脾脏T细胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表达 与对照组比较，模型组Teff 细胞IL-2 mRNA表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，胶囊组、强的松组Teff 细胞IL-2 mRNA 表达量下调（P均＜0.05）。与对照组比较，模型组Tregs 细胞Foxp3 mRNA 表达量降低（P＜0.05）；与模型组比较，胶囊组、强的松组Tregs 细胞Foxp3 mRNA 表达量升高（P均＜0.05）。胶囊组、强的松组T 细胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表达量比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠T细胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表达比较（± s）

表2 各组小鼠T细胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表达比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

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3 讨论

研究显示，ITP 发病机制包括机体自身免疫失调导致的巨核细胞系成熟障碍、血小板生成减少、血小板破坏过多［2］。临床上可以选用的ITP 治疗药物有糖皮质激素、利妥昔单抗、血小板生成素受体激动剂等［3］。但是以上临床用药多伴有各种不良反应发生，且存在耐药现象，可导致重要脏器出血及临床疗效的下降，因此迫切需要更加安全有效的治疗方法。研究证实，ITP 患者中存在免疫系统功能紊乱，其中Tregs 细胞数量及功能降低可导致免疫监视功能下调，单核巨噬细胞破坏血小板增多，是ITP 发生的一个重要病理机制［4］。因此上调Tregs 细胞，提高Tregs 细胞的数量与功能，恢复机体的免疫监视系统；同时抑制Teff 细胞增殖，减少B 细胞分泌产生血小板自身抗体［5］，将为ITP开拓新的治疗靶点。

血小板胶囊是一种复方纯中药制剂。君药是青黛，作用是清热解毒、凉血消斑；臣药是牡丹皮，功能是凉血散淤；佐药为疏风散结之连翘以及收敛止血的仙鹤草；应用甘草调和诸药，最终达到清热解毒、凉血止血、散淤消斑之功。动物实验证明，青黛除清热解毒凉血、抗癌的作用外，可促进体外培养的小鼠胸腺及脾脏T 淋巴细胞增殖，并且药量与药效呈现正量效关系，提示青黛能够调节免疫系统功能［6］。另有动物实验证明，牡丹皮和连翘不仅能降低毛细血管通透性，还可以调节机体免疫功能，并且不具有肾上腺皮质激素样的各种不良反应。佐药连翘还能阻断T 淋巴细胞活化并抑制增殖［7］。本研究应用升血小板胶囊治疗ITP 模型小鼠，结果显示治疗后小鼠外周血血小板计数增加，伴有Tregs细胞数量及其分泌Foxp3 水平提升，Teff 细胞及其分泌产生的IL-2水平降低。提示升血小板胶囊治疗可以显著提高Tregs 细胞比例及功能，改善机体的免疫监视状态，对ITP有较好的治疗效果。

ITP 患者体内的细胞因子处于失衡状态［8］。Tregs 细胞本身不分泌IL-2［9］，但可以利用Teff 细胞分泌的IL-2并形成反馈回路来调节免疫系统。在本研究中经升血小板胶囊治疗后ITP 小鼠的Tregs 细胞数量增加、功能改善，能够有效抑制Teff 细胞功能，使Teff 细胞分泌的IL-2 减少，从而恢复免疫耐受，减轻免疫性血小板减少患者症状［10-11］。本研究ITP 小鼠的Teff细胞IL-2 mRNA 表达高于对照组，提示ITP 小鼠免疫监视的不足导致免疫逃逸状态的存在。随着升血小板胶囊治疗后Tregs 细胞比例的升高，IL-2 mRNA 表达明显降低，提示Teff 细胞的免疫逃逸被成功抑制，从而恢复Tregs细胞的免疫监视功能，促进ITP病理状态的恢复好转。

综上所述，升血小板胶囊通过提高Tregs细胞介导的免疫监视，抑制Teff 细胞功能，减少IL-2 分泌，减轻由此引发的免疫病理异常导致的相关血小板损害，促进免疫耐受，发挥升高血小板的治疗作用，对ITP 小鼠有良好疗效。