姜黄素固体脂质纳米粒在大鼠体内的组织分布研究 Δ

李旭，郝迪，王梓，李楠 （天津市医药科学研究所，天津 300020）

心肾综合征（cardiorenal syndrome，CRS）指心脏和肾脏中一个器官对另一个器官的功能损害不能进行代偿时，形成恶性循环，最终导致心脏和肾脏功能的共同损害；其发病机制复杂，心肾纤维化是其终末期的主要病理改变，目前尚无特效药物进行治疗[1―3]。姜黄素（curcumin，Cur）可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化和肾间质纤维化[4―5]。本课题组前期研究发现，Cur还可改善CRS模型大鼠的心肌肥大、肾功能以及肺组织损伤[6]。Cur的生物利用度极低（＜1%）且难溶于水（溶解度为0.6 μg/mL），在生理pH下的吸收和稳定性较差，且代谢快、易消除[7―8]，从而限制了其体内研究和临床应用。

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）以脂质作为载体材料将药物包裹在其中，可避免药物与外界环境接触，增加药物的稳定性，延长药物的半衰期，从而提高药物的生物利用度[9―11]。本课题组前期采用微乳法制备了Cur-SLN[12]，现采用尾静脉注射Cur-SLN的方法，观察Cur在大鼠心、肾、肺和肝组织的分布情况，以期为Cur-SLN治疗CRS的临床应用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有LC-2010型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司），XW-80A型涡旋混合仪（上海医科大学仪器厂），HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），XW-80A型定时恒温磁力搅拌器（上海泸西分析仪器厂），PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），SZ-100型纳米粒度仪（日本Horiba公司），AB135型十万分之一电子天平、AL204型万分之一电子分析天平、PL203型精密电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]等。

1.2 主要药品与试剂

Cur对照品、大黄素对照品（内标）均购自中国食品药品检定研究院（批号分别为110823-201004、110756-200110，纯度均大于98%）；Cur原料药（批号TZSW200317-1，纯度99.0%）购自西安通泽生物科技有限公司；其余试剂均为实验室常用规格，水为娃哈哈纯净水。

1.3 动物

本研究所用实验动物为SPF级SD大鼠，共90只，雄性，体质量220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0006。所用动物均活动正常且毛发柔顺，摄食、饮水均正常。本研究获得天津市医药科学研究所伦理委员会批准，伦理审批号为IMPS-EAEP-Z-18JCQNJC13500-01。

2 方法与结果

2.1 Cur-SLN混悬液的制备

参考本课题组前期方法制备Cur-SLN混悬液[12]：称取处方量的Cur和硬脂酸，于65 ℃熔化，加入2 mL相同温度的聚山梨酯80-乙醇溶液（质量比1∶4）和8 mL水，涡旋1 min，即得水包油型微乳。在电磁搅拌（1 020 r/min）下，将上述热微乳以每5 s 1滴的速度滴入2 ℃的分散介质水中，当微乳全部加入后继续以2 ℃保温搅拌15 min，即得Cur-SLN混悬液（每毫升Cur-SLN中含Cur原料药约0.77 mg，载药量为7.72%，包封率为87.73%）。本研究所制Cur-SLN的理化性质良好，平均粒径为（168.9±1.0） nm，Zeta电位为－（19.60±0.35） mV，多分散系数为0.212±0.020。

2.2 生物样品中Cur含量测定方法的建立

采用HPLC法检测大鼠各组织样品中Cur的含量。

2.2.1 色谱条件 以DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 μm，5 mm）为色谱柱，以乙腈-0.50%磷酸溶液（58∶42，V/V）为流动相；检测器为紫外检测器，检测波长为426 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为20 μL。

2.2.2 溶液的制备 （1）Cur对照品贮备液：精密称取Cur对照品13.21 mg于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.321 mg/mL的Cur对照品贮备液，于4 ℃冰箱中保存。临用前用甲醇稀释制成相应质量浓度的标准溶液。（2）大黄素对照品溶液：精密称取内标大黄素对照品20 mg于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为200 μg/mL的内标溶液，于4 ℃避光保存。

2.2.3 组织样品的处理 将大鼠的心、肺、肾和肝剪碎后，按照称定质量的2倍加入生理盐水匀浆，转移至离心管中，以4 000 r/min离心10 min，吸取上清液180 μL，精密加入大黄素对照品溶液20 μL、乙酸乙酯-甲醇混合溶剂（体积比为9∶1）1 mL，涡旋3 min后，以12 000 r/min离心10 min；小心吸取上层有机溶剂900 μL转移至另一离心管中，以氮气吹干，残渣加甲醇100 μL复溶，涡旋2 min，以12 000 r/min离心10 min，取上清液进样测定。

2.2.4 专属性考察 取空白心、肺、肾和肝组织样品，各空白组织+Cur（0.647 5 μg/mL）样品以及大鼠给药后0.5 h的组织样品各适量，按“2.2.3”项下方法处理（空白组织样品不需要添加内标）后，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，Cur和大黄素的保留时间分别约为10.1、15.0 min，2个色谱峰互不干扰且峰形良好，理论板数以Cur和大黄素计均不低于2 000，且各样品中的内源性物质不干扰Cur的测定，表明该色谱条件下专属性良好。结果见图1～图3。

图1 空白组织样品的HPLC图

图2 空白组织+Cur+内标的HPLC图

图3 给药后0.5 h各组织样品+内标的HPLC图

2.2.5 线性关系、定量下限、检测限的考察 取质量浓度为1.321 mg/mL的Cur对照品贮备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为1 295.00、647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列标准溶液。分别精密吸取心、肾和肝组织的空白匀浆液180 μL，加入上述系列标准溶液20 μL，然后按“2.2.3”项下方法处理，即得Cur质量浓度分别为129.5、64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列标准心、肾、肝组织样品溶液。同法精密吸取肺组织空白匀浆液，加入647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列标准溶液，同前处理，得Cur质量浓度分别为64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列标准肺组织样品溶液。将上述组织样品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以组织样品中Cur的质量浓度（X）为横坐标、Cur与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标进行线性回归，以线性范围最低值为定量下限，以信噪比3∶1计算检测限。结果见表1。

表1 不同组织中Cur的线性关系、定量下限、检测限的考察结果

2.2.6 精密度与准确度试验 取Cur对照品适量，加入空白组织样品溶液，按“2.2.3”项下方法制备含Cur定量下限质量浓度的组织样品溶液以及含Cur低、中、高质量浓度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的组织样品溶液，每个质量浓度平行制备6份。按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，考察各样品中Cur质量浓度的日内精密度和准确度；连续3 d进样，考察批间精密度和准确度。结果显示，各样品日内、日间RSD均小于15%（n＝6），准确度均值在标示值的±15%之内，符合生物样品定量分析的要求[13]。

2.2.7 提取回收率 按“2.2.3”项下方法配制含Cur低、中、高质量浓度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的组织样品溶液，各6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录Cur峰面积（As）和大黄素（内标）峰面积（Ai）。另取空白组织样品，同法预处理至氮气吹干，在残渣中加入低、中、高质量浓度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的Cur对照品贮备液20 μL，大黄素对照品溶液20 μL、甲醇60 μL，涡旋2 min；以12 000 r/min离心10 min，各质量浓度平行6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录未经提取的Cur峰面积（As’）和大黄素峰面积（Ai’）。分别计算Cur和大黄素的提取回收率：Cur提取回收率（%）＝As/As’×100%；大黄素提取回收率（%）＝Ai/Ai’×100%。结果显示，低、中、高质量浓度的Cur在心脏组织中的提取回 收 率 分 别 为（89.72±2.13）% 、（92.68±0.74）% 、（97.31±1.45）%，在肺组织中分别为（91.77±1.86）%、（96.27±1.07）%、（98.11±0.37）%，在肾组织中分别为（90.56±2.64）%、（95.19±0.93）%、（97.81±0.11）%，在肝组织中分别为（93.80±3.62）%、（97.77±1.07）%、（95.46±3.47）%，RSD均小于5%（n＝6）；大黄素在心、肺、肾、肝组织中的提取回收率分别为95.21%、94.38%、96.12%、95.72%，RSD均小于4%（n＝6），符合生物样品定量分析的要求[13]。

2.2.8 稳定性试验 按“2.2.3”项下方法制备含Cur低、中、高质量浓度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的组织样品溶液，各3份，考察其于25 ℃放置24 h、－40 ℃放置24 h、反复冻融（－40 ℃～室温）3次的稳定性。结果显示，各样品测得质量浓度与理论质量浓度的相对误差（RE）均在±15%范围内，提示样品在上述条件下稳定性良好[13]。

2.3 Cur-SLN在大鼠心、肾、肺、肝组织的分布考察

2.3.1 分组、给药与样品采集 将大鼠随机分为Cur原料药组和Cur-SLN组，每组45只。于给药前12 h开始禁食不禁水，参考文献[14―15]给药方法，两组大鼠分别尾静脉注射Cur原料药混悬液（以含0.5%聚山梨酯80的生理盐水溶液溶解，临用现配）和Cur-SLN混悬液，以Cur计注射剂量为25 mg/kg。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h时，各组分别取5只大鼠用乙醚麻醉，然后处死，解剖分离大鼠的心、肺、肾和肝组织，用生理盐水将组织表面的残血洗净，定性滤纸吸干后精确称质量，然后置于离心管内，保存备用。

2.3.2 Cur-SLN给药后的组织分布 取给药后不同时间点各组织样品适量，按“2.2.3”项下方法处理后，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并代入标准曲线计算不同时间点各组织样品中Cur的含量。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，数据均以±s表示，组间比较采用t检验。检验水准α＝0.05。结果显示，与Cur原料药相应组织样品组比较，Cur-SLN组大鼠心、肾、肺（0.25～24 h各时间点）和肝（0.25～1 h、12～24 h各时间点）组织样品中Cur的含量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各时间点）组织样品中Cur的含量则显著降低（P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠给药不同时间点后各组织样品中Cur含量的测定结果（±s，n＝5，μg/mL）

表2 各组大鼠给药不同时间点后各组织样品中Cur含量的测定结果（±s，n＝5，μg/mL）

a：与Cur原料药组同时间点同组织样品比较，P＜0.05；b：与Cur原料药组同时间点同组织样品比较，P＜0.01

样品Cur原料药组心脏组织Cur原料药组肺组织Cur原料药组肾组织Cur原料药组肝组织Cur-SLN组心脏组织Cur-SLN组肺组织Cur-SLN组肾组织Cur-SLN组肝组织24 h 0.41±0.21 0.23±0.12 1.63±0.35 0.62±0.10 12.57±0.43b 11.24±0.81b 10.92±1.01b 7.82±0.59b 0.25 h 2.67±1.25 0.95±1.34 7.21±2.99 1.82±0.35 7.19±1.18a 13.35±1.13b 18.95±0.31b 25.07±1.17b 0.5 h 6.46±1.87 2.98±1.78 13.32±1.62 8.77±0.40 16.42±1.97b 27.12±1.79b 32.97±1.43b 32.63±0.86b 1 h 13.24±2.51 4.35±1.01 18.09±7.27 42.17±1.17 36.79±0.41b 31.63±0.33b 42.51±2.12b 47.17±1.35b 2 h 16.34±4.11 8.21±0.92 21.75±1.24 75.40±2.21 43.84±0.55b 44.97±0.21b 57.35±3.61b 67.77±1.40b 4 h 12.72±1.44 4.86±1.02 13.35±0.46 120.43±1.92 50.12±3.99b 49.21±0.27b 63.38±1.41b 75.43±0.76b 6 h 7.31±1.23 3.77±0.56 10.13±0.31 63.73±1.40 68.91±0.46 b 56.42±2.30b 80.64±2.49b 52.14±1.57b 8 h 3.92±1.31 2.18±1.59 6.46±1.25 28.87±1.25 21.32±0.68b 22.62±0.39b 25.31±2.23b 23.47±0.93b 12 h 1.09±0.12 0.59±1.20 5.42±1.98 3.48±0.30 16.41±2.11b 17.21±0.61b 16.51±3.17a 10.01±0.73b

3 讨论

纳米技术的迅速发展为人类很多重大疾病的治疗提供了新机会。纳米药物能够提高难溶性药物的有效性和安全性，在药物递送系统中起着非常重要的作用[16]。Cur具有多种药理活性，且毒性低、药源充足，但其生物利用度低，限制了其在临床中的应用[17]。SLN是一种针对低生物利用度活性成分的理想递药系统[18]，能在一定程度上提高药物的生物利用度。

本课题组前期采用微乳法制备了Cur-SLN，并对其进行了质量评价和体外释药研究，其包封率为87.73%、载药量为7.72%、平均粒径为（168.9±1.0） nm、多分散系数为0.212±0.02[12]，表明本课题组所制的Cur-SLN粒度均匀，理化性质良好。本研究以Cur原料药为参照，采用大鼠尾静脉给药后，考察Cur-SLN在大鼠心、肾、肺和肝组织中的分布情况。结果发现，与Cur原料药组比较，Cur-SLN组大鼠心、肾、肺（0.25～24 h各时间点）和肝（0.25～1 h、12～24 h各时间点）组织样品中Cur的含量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各时间点）组织样品中Cur的含量则显著降低（P＜0.01）。由此可知，采用SLN负载Cur后，增加了Cur在心、肾、肺组织中的分布，延长了其在心、肾、肺组织中的相对滞留时间，有利于提高Cur在体内的生物利用度。静脉给药1 h后，Cur在肝组织中的分布先明显减少，12 h后又显著增加，这可能是由于各个组织中的药物浓度和药量分布是一个变化的过程，带负电荷的SLN易在肝组织中蓄积，从而出现肝组织药物分布的双峰现象。

综上所述，本研究将Cur制成SLN后，增加了其在心、肾、肺组织的分布。